Studium der Protein Import in Chloroplasten mit Protoplasten
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Proteine in Protoplasten zum Ausdruck zu bringen, mit PEG-vermittelten Transformationsmethode. Die Methode bietet einfach Ausdruck der interessierenden Proteine und effiziente Untersuchung von Protein-Lokalisierung und der Importvorgang für verschiedenen experimentellen Bedingungen in-vivo.
Abstract
Die Chloroplasten ist eine wesentliche Organellen, die für verschiedene zelluläre Prozesse in Pflanzen wie Photosynthese und die Produktion von vielen sekundären Pflanzenstoffen und Lipiden ist. Chloroplasten erfordern eine große Zahl von Proteinen für diese verschiedenen physiologischen Prozesse. Über sind 95 % der Chloroplasten Proteine Zellkern codiert und in Chloroplasten aus dem Cytosol importiert nach der Übersetzung auf cytosolische Ribosomen. Somit ist die ordnungsgemäße Einfuhr oder Ausrichtung dieser Kern-codierte Chloroplasten Proteine zu Chloroplasten entscheidend für das reibungslose Funktionieren der Chloroplasten sowie der Pflanzenzelle. Kern-codierte Chloroplasten Proteine enthalten Signalsequenzen für spezifische Ausrichtung auf Chloroplasten. Molekulare Maschinen, die in den Chloroplasten oder Zytosol lokalisiert diese Signale zu erkennen und führen Sie den Importvorgang. Um die Mechanismen der Protein Import oder Ausrichtung auf Chloroplasten in Vivozu untersuchen, haben wir eine schnelle, effiziente Protoplasten basierende Methode zur Analyse von Protein Import in Chloroplasten von Arabidopsis entwickelt. Bei dieser Methode verwenden wir Protoplasten von Blatt Gewebe von Arabidopsisisoliert. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von Protoplasten, um den Mechanismus zu untersuchen, mit dem Proteine in Chloroplasten importiert werden.
Introduction
Die Chloroplasten ist eines der wichtigsten Organellen in Pflanzen. Eine der Hauptfunktionen der Chloroplasten soll Photosynthese1durchführen. Chloroplasten führen auch viele andere biochemischen Reaktionen für die Produktion von Fettsäuren, Aminosäuren, Nukleotide und zahlreiche sekundäre Pflanzenstoffe1,2. Für all diese Reaktionen erfordern Chloroplasten eine große Anzahl von verschiedenen Arten von Proteinen. Das Chloroplast Genom enthält jedoch nur etwa 100 Gene3,4. Daher müssen Chloroplasten den Großteil ihrer Proteine aus dem Cytosol importiert. In der Tat zeigten die meisten Chloroplasten Proteine nach Übersetzung4,5,6aus dem Cytosol importiert werden. Pflanzenzellen erfordern spezifische Mechanismen, Proteine aus dem Zytosol in Chloroplasten zu importieren. Doch obwohl diese Protein Import Mechanismen für die letzten Jahrzehnte untersucht wurden, verstehen wir noch nicht voll sie auf molekularer Ebene. Hier bieten wir eine detaillierte Methode für die Vorbereitung von Protoplasten und Gene im Protoplasten exogen zum Ausdruck zu bringen. Diese Methode kann für die Aufklärung der molekularen Mechanismen Protein Import in Chloroplasten im Detail sein.
Protein Import kann mit viele verschiedene Ansätze untersucht werden. Eine der folgenden Methoden beinhaltet die Verwendung von in-vitro- Protein Import System7,8. Mit diesem Ansatz, in-Vitro-übersetzte Protein Vorstufen sind mit gereinigtem Chloroplasten in Vitroinkubiert und Protein Import von SDS-PAGE gefolgt von western-Blot Analyse analysiert. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass jeder Schritt von Protein Import in Chloroplasten im Detail untersucht werden kann. Daher hat diese Methode, die Komponenten der Protein Import molekulare Maschinerie zu definieren und Sequenzinformation für Transit Peptide sezieren verbreitet. In jüngerer Zeit, ein weiterer Ansatz unter Verwendung von Protoplasten von Blatt Gewebe wurde entwickelt und es wurde weithin Protein Import in Chloroplasten9,10Studium verwendet werden. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass Protoplasten eine zelluläre Umgebung bereitstellen, die näher an der intakten Zellen als die in-Vitro -System ist. Die Protoplasten System ermöglicht so viele zusätzliche Aspekte dieses Prozesses, wie die damit verbundenen cytosolischen Ereignisse und wie die Spezifität des Zielens Signale bestimmt wird. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von Protoplasten Protein Import in Chloroplasten zu studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir stellten ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von Protoplasten von Arabidopsis Protein Import in Chloroplasten zu studieren. Diese Methode ist für die Untersuchung von Protein-Importvorgang mächtig. Diese einfache und vielseitige Technik eignet sich für die Prüfung, die Angriffe auf die vorgesehene Ladung Proteine Chloroplasten. Mit dieser Methode werden Protoplasten von Blatt Gewebe von Arabidopsis11,12 zubereitet zu vielen v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeiten erfolgten mit den Stützen der Cooperative Research Program für Agrarwissenschaft und Technologie-Entwicklung (Projekt Nr. PJ010953012018), Rural Development Administration und der National Research Foundation (Korea) Zuschuss gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft und IKT (Nr. 2016R1E1A1A02922014), Republik Korea.
Materials
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
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