לומד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט באמצעות Protoplasts
Summary
כאן נתאר פרוטוקול כדי להביע את החלבונים לתוך protoplasts באמצעות שיטת שינוי בתיווך פג. השיטה מספקת קל ביטוי של חלבונים עניין ולאחר חקירה יעילה של חלבון לוקליזציה, תהליך הייבוא בתנאי ניסוי שונים ויוו.
Abstract
כלורופלסט הוא אברון חיוני כי הוא אחראי על תהליכים שונים התאית בצמחים, כגון פוטוסינתזה וייצור של מטבוליטים משניים רבים ושומנים. מהכלורופלסט לדרוש מספר רב של חלבונים אלה תהליכים פיזיולוגיים שונים. מעל 95% של כלורופלסט חלבונים הם מקודד גרעין והן מיובאים לתוך מהכלורופלסט של ציטוזול לאחר התרגום ריבוזומים cytosolic. לפיכך, הייבוא נכונה או פילוח של חלבונים אלה כלורופלסט מקודד גרעין כדי מהכלורופלסט חיוני לתפקוד תקין של מהכלורופלסט, כמו גם על תא צמח. כלורופלסט גרעין מקודדת חלבונים מכילים רצפי אותות פילוח מסוים כדי מהכלורופלסט. מכונות מולקולריות מקומי כלורופלסט או ציטוזול מזהה אותות אלה ולבצע את תהליך הייבוא. כדי לחקור את המנגנונים של חלבון ייבוא או המיקוד מהכלורופלסט ויוו, פיתחנו מהיר, יעיל מבוססי פרוטופלאסט שיטה לנתח חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט של תודרנית. בשיטה זו, אנו משתמשים protoplasts מבודד מן העלים רקמות של תודרנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור שימוש protoplasts כדי לחקור את המנגנון שבאמצעותו חלבונים מיובאות לתוך מהכלורופלסט.
Introduction
כלורופלסט הוא אחד organelles החשובים ביותר צמחים. אחת מהפונקציות העיקריות של מהכלורופלסט היא לבצע פוטוסינתזה1. מהכלורופלסט לבצע גם רבים תגובות ביוכימיות אחרות לייצור של חומצות שומן, חומצות אמינו, נוקלאוטידים ו מטבוליטים משניים רבים1,2. עבור כל תגובות אלו, מהכלורופלסט דורשים מספר רב של סוגים שונים של חלבונים. עם זאת, הגנום כלורופלסט מכיל רק כ-100 גנים3,4. לכן, מהכלורופלסט עליך לייבא את רוב החלבונים שלהם ציטוזול. למעשה, רוב החלבונים כלורופלסט הראו להם אפשרות לייבא את ציטוזול לאחר תרגום-4,–5,–6. תאי צמחים דורשים למנגנונים הספציפיים כדי לייבא חלבונים מן ציטוזול מהכלורופלסט. עם זאת, למרות מנגנונים ייבוא חלבונים אלה נחקרו מספר עשורים, אנחנו עדיין לא מבינים לחלוטין אותם ברמה המולקולרית. כאן, אנו מספקים שיטה מפורטת עבור הכנת protoplasts ולבטא exogenously גנים protoplasts. שיטה זו יכולה להיות יקר עבור שחקרתי את המנגנונים המולקולריים שבבסיס חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט בפירוט.
חלבון הייבוא ניתן יהיה ללמוד שימוש בגישות שונות רבות. אחת משיטות אלה כרוכה בשימוש במבחנה חלבון ייבוא מערכת7,8. שימוש בגישה זו במבחנה-חלבון מתורגם מבשרי מודגרת עם מהכלורופלסט מטוהרים במבחנה, ומנותח חלבון הייבוא על-ידי מרחביות-דף ואחריו תספיג ניתוח. היתרון של גישה זו הוא כי כל שלב של חלבון ייבוא לתוך מהכלורופלסט ניתן יהיה ללמוד בפירוט. לכן, בשיטה זו כבר בשימוש נרחב כדי להגדיר את הרכיבים של המנגנון המולקולרי של ייבוא חלבון וכדי לנתח מידע רצף עבור המעבר פפטידים. לאחרונה, גישה אחרת הכרוכות של protoplasts רקמות עלים פותחה, יש להיות בשימוש נרחב ללמוד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט9,10. היתרון של גישה זו הוא כי protoplasts מספקים סביבה הסלולר זה קרוב לזה של תאים שלמים מאשר מערכת במבחנה . לפיכך, המערכת פרוטופלאסט מאפשרת לנו להתייחס היבטים נוספים של תהליך זה, כגון האירועים הקשורים cytosolic, איך נקבע ייחודה של פילוח אותות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט על השימוש protoplasts ללמוד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט.
Protocol
Representative Results
Discussion
סיפקנו פרוטוקול מפורט על השימוש protoplasts של תודרנית ללמוד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט. שיטה זו היא חזקה על חקירת תהליך הייבוא חלבון. טכניקה זו פשוטה, תכליתי שימושית לבחינת הפגיעה המכוונת החלבונים מטענים המיועד ל מהכלורופלסט. באמצעות שיטה זו, protoplasts מוכנות רקמות עלים של תודרנית<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו בוצע עם תומך של הקואופרטיב תוכנית מחקר מדעי החקלאות ופיתוח טכנולוגיה (פרויקט מס ‘ PJ010953012018), ניהול פיתוח כפרי, המענק קרן מחקר לאומי (קוריאה) ממומן על ידי משרד המדע ICT (מספר 2016R1E1A1A02922014), הרפובליקה של קוריאה.
Materials
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
References
- Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
- Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
- Jarvis, P. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).
- Li, H. M., Chiu, C. C. Protein Transport into Chloroplasts. Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).
- Keegstra, K., Cline, K. Protein import and routing systems of chloroplasts. Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).
- Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).
- Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments. Cell. 46 (3), 365-375 (1986).
- Lee, D. W., et al. Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).
- Lee, S., et al. Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).
- Jin, J. B., et al. A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).
- Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts. Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).
- Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts. Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).
- Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts. Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).
- Lee, J., et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells. Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).
- Cleary, S. P., et al. Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).
