Summary

Önceki kullanarak kloroplast eğitim Protein içe aktarma işlemi

Published: December 10, 2018
doi:

Summary

Burada PEG aracılı dönüşüm yöntemi kullanarak önceki proteinler ifade için bir protokol açıklayın. Kolay ifade ilgi protein ve protein yerelleştirme ve çeşitli deneysel koşullar için alma işlemini verimli soruşturma yöntemdir içinde vivo.

Abstract

Kloroplast bitkilerde fotosentez ve birçok sekonder metabolitler ve lipidler üretimi gibi çeşitli hücresel süreçler sorumlu bir önemli organel olduğunu. Kloroplast proteinler, çok sayıda bu çeşitli fizyolojik işlemlerini gerçekleştirmek için gerekir. Üzerinde kloroplast proteinlerin % 95’i sitozolik ribozomlara çeviri sonra çekirdek kodlanmış ve kloroplast sitozol üzerinden içine alınan. Böylece, uygun alma veya bu çekirdeği kodlanmış kloroplast proteinler kloroplast için hedefleme kloroplast yanı sıra bitki hücre düzgün çalışması için gereklidir. Çekirdeği kodlanmış kloroplast proteinler belirli kloroplast için hedefleme için sinyal sıraları içerir. Moleküler makine kloroplast veya sitozol lokalize bu sinyalleri tanımak ve alma işlemi taşımak. Protein alma veya kloroplast içinde vivoiçin hedefleme mekanizmaları araştırmak için Arabidopsis kloroplast protein içe aktarma işlemi çözümlemek için bir hızlı, verimli protoplast tabanlı yöntemi geliştirdi. Bu yöntemde, Arabidopsisyaprak dokulardan izole önceki kullanın. Burada, biz tarafından proteinler kloroplast alındığı mekanizması araştırmak için önceki kullanımı için detaylı bir protokol sağlar.

Introduction

Kloroplast tesislerinde en önemli organelleri biridir. Kloroplast ana işlevleri fotosentez1taşımak için biridir. Kloroplast da yağ asitleri, amino asitler, nükleotit ve çok sayıda sekonder metabolitler1,2üretimi için birçok biyokimyasal reaksiyonlar yürütmek. Tüm bu tepkiler, proteinlerin farklı türleri, çok sayıda kloroplast gerektirir. Ancak, kloroplast genom sadece yaklaşık 100 gen3,4içerir. Bu nedenle, kloroplast onların proteinler çoğunluğu sitozol almanız gerekir. Aslında, çoğu kloroplast proteinler sitozol çeviri4,5,6sonra alınmak üzere gösterilmiştir. Bitki hücreleri proteinler sitozol kloroplast için almak için belirli mekanizmaları gerektirir. Her ne kadar son birkaç yıldır bu protein alma mekanizmaları araştırdık, ancak, biz hala tam olarak onları moleküler düzeyde anlamıyorum. Burada, biz önceki hazırlanması ve exogenously önceki genlerinde ifade için detaylı bir yöntem sağlar. Bu yöntem protein alma kloroplast ayrıntılı içine temel moleküler mekanizmaları elucidating için değerli olabilir.

Protein alma birçok farklı yaklaşımlar kullanarak okudu olabilir. Bu yöntemlerden birini vitro protein alma sistem7,8kullanımını gerektirir. Bu yaklaşım, vitro-çevrilmiş protein öncüleri arıtılmış kloroplast vitroile inkübe ve protein alma tarafından SDS-sayfası western blot Analizi tarafından takip analiz edilebilir. Bu yaklaşımın avantajı olduğunu protein alma her adım kloroplast içine ayrıntılı olarak incelenecektir. Bu nedenle, bu yöntem yaygın protein alma moleküler makine bileşenleri tanımlamak için ve sırası bilgi için transit peptidler incelemek için kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, başka bir yaklaşım önceki yaprak dokuları üzerinden kullanımını içeren geliştirilmiş ve yaygın olarak protein alma kloroplast9,10içine eğitim için kullanılır hale. Bu yaklaşımın avantajı önceki vitro sistemi daha sağlam hücreleri olan yakın bir hücresel ortamı sağlamaktır. Böylece, protoplast sistem bize bu işlem, ilişkili sitozolik olaylar ve sinyalleri hedefleme özgüllüğü belirleme gibi birçok ek yönlerini ele sağlar. Burada, protein ithal etmek içine kloroplast çalışmaya önceki kullanımı için detaylı bir protokol mevcut.

Protocol

1. Arabidopsis bitkilerin büyüme 1 L Gamborg B5 hazırlamak B5 orta 3.2 g ekleyerek (B5) orta vitaminler, 20 g sükroz, yaklaşık 800 ml deiyonize su 2-(N-morpholino) etan sülfonik asit (MES) 0.5 g de dahil olmak üzere ve pH 5.7 ile potasyum hidroksit (KOH) için ayarlayın. Ekle daha deiyonize su getir toplam hacim 1 L. eklemek 8 g phytoagar ve otoklav 121 ° C’de 15 dakika için Aşağı 55 ° C serin ve temiz bir Bank, Petri kabına (9 cm çapında, yüksekliği 1,5 cm) içine B5 orta 20 – 2…

Representative Results

İçe aktarma işlemi proteinlerin kloroplast iki yaklaşım kullanılarak incelenebilir: floresans mikroskobu ve immunoblot analizden sonra SDS-sayfa-aracılı ayırma. Burada, biz RbcS kullanılır-nt:GFP, bir füzyon oluşturmak için GFP erimiş transit peptid içeren RbcS 79 N-terminal amino asit kalıntıları kodlama. Proteinler kloroplast alındığında, yeşil floresans hedef protein RbcS sinyalleri-nt:GFP birleştirme ile klorofil auto-floresan, gelen kırmızı floresan sinyal…

Discussion

Biz protein ithal etmek içine kloroplast çalışmaya Arabidopsis önceki kullanımı için detaylı bir protokol sağladı. Bu protein alma işlemi soruşturma için güçlü bir yöntemdir. Bu basit, çok yönlü teknik kloroplast için amaçlanan kargo proteinlerin hedefleme incelenmesi için yararlıdır. Bu yöntemi kullanarak, önceki yaprak dokuları tam olgun yaprakları çok erken arasında değişen birçok farklı büyüme aşamalarında bitkilerden elde Arabidopsis11

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser kooperatif araştırma programı destekler ile tarım bilim ve teknoloji geliştirme (Proje No için yapılmıştır PJ010953012018), Kırsal Kalkınma İdaresi ve ICT (No. 2016R1E1A1A02922014) ve Bilim Bakanlığı tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı (Kore) hibe Kore.

Materials

GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS Duchefa Biochemie G0210.0050
SUCROSE Duchefa Biochemie S0809.5000
MES MONOHYDRATE Duchefa Biochemie M1503.0250
Agar, powder JUNSEI 24440S1201
Micropore Surgical tape 3M 1530-0
Surgical blade stainless No.10 FEATHER Unavailable
Conical Tube, 50ml SPL LIFE SCIENCES 50050
Macerozyme R-10 YAKULT PHARMACEUTICAL IND. Unavailable
Cellulase ONOZUKA R-10 YAKULT PHARMACEUTICAL IND. Unavailable
ALBUMIN, BOVINE (BSA) VWR 0332-100G
D-Mannitol SIGMA M1902-1KG
CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE MP BIOMEDICALS 0219463505-5KG
Twister VISION SCIENTIFIC VS-96TW
Screen cup for CD-1 SIGMA S1145
Screens for CD-1 SIGMA S3895
Petri Dish SPL LIFE SCIENCES 10090
Pasteur pipette HILGENBERG 3150102
LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP VISION SCIENTIFIC VS-5500N
Sodium chloride JUNSEI 19015S0350
Potassium chloride SIGMA P3911-1KG
D-GLUCOSE, ANHYDROUS BIO BASIC GB0219
Potassium Hydroxide DUKSAN 40
Calcium nitrate tetrahydrate SIGMA C2786-500G
Poly(ethylene glycol) SIGMA P2139-2KG
Magnesium chloride hexahydrate SIGMA M2393-500G
Tube 13ml, 100x16mm, PP SARSTEDT 55.515
Microscope slides MARIENFELD 1000412
Microscope Cover Glasses MARIENFELD 101030
Counting Chamber MARIENFELD 650030
Axioplan 2 Imaging Microscope Carl Zeiss Unavailable
Micro tube 1.5ml SARSTEDT 72.690.001
2-Mercaptoethanol SIGMA M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade VWR M107-500G
TRIS, Ultra Pure Grade VWR 0497-5KG
DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade VWR 0281-25G
Bromophenol blue sodium salt ACS VWR 0312-50G
Glycerol JUNSEI 27210S0350
Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) TAKARA 632381

References

  1. Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
  3. Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
  4. Jarvis, P. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).
  5. Li, H. M., Chiu, C. C. Protein Transport into Chloroplasts. Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).
  6. Keegstra, K., Cline, K. Protein import and routing systems of chloroplasts. Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).
  7. Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).
  8. Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments. Cell. 46 (3), 365-375 (1986).
  9. Lee, D. W., et al. Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).
  10. Lee, S., et al. Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).
  11. Jin, J. B., et al. A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).
  12. Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts. Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).
  13. Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts. Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).
  14. Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts. Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).
  15. Lee, J., et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells. Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).
  16. Cleary, S. P., et al. Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).

Play Video

Cite This Article
Lee, J., Kang, H., Hwang, I. Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts. J. Vis. Exp. (142), e58441, doi:10.3791/58441 (2018).

View Video