Summary

Изучая белка импорта в хлоропластов, используя протопластов

Published: December 10, 2018
doi:

Summary

Здесь мы описываем протокол выразить белков в протопласта, используя метод PEG-опосредованной преобразования. Этот метод обеспечивает простой выражение протеинов интереса, и эффективное расследование локализация протеина и процесс импорта для различных экспериментальных условий в vivo.

Abstract

Хлоропластов является важным органелл, который отвечает за различные клеточные процессы в растениях, таких как фотосинтез и производство многих вторичных метаболитов и липиды. Хлоропласты требуют большое количество белков для этих различных физиологических процессов. Более 95% белков хлоропласта ядро кодировке и импортированы в хлоропластах от цитозоль после перевода на цитозольной рибосом. Таким образом правильного импорта или ориентации этих белков ядро кодировке хлоропластов в хлоропластах имеет важное значение для надлежащего функционирования хлоропластов, а также растительной клетки. Ядро кодировке хлоропласта протеины содержат сигнальные последовательности для конкретной ориентации в хлоропластах. Молекулярные машины, локализованные в хлоропласте или цитозоль признать эти сигналы и выполнения процесса импорта. Для изучения механизмов импорта белка или ориентации хлоропластов в естественных условиях, мы разработали быстрого, эффективного метода, основанного на протопластов, для анализа белка импорта в хлоропластах арабидопсиса. В этом методе мы используем протопласта, изолированных от листовой ткани Arabidopsis. Здесь мы предоставляем подробный протокол для использования протопласта исследовать механизм, по которому белки импортируются в хлоропластах.

Introduction

Хлоропластов является одним из наиболее важных органеллы в растениях. Одна из основных функций хлоропласты — осуществлять фотосинтез1. Хлоропласты осуществляют также многих других биохимических реакций для производства жирных кислот, аминокислот, нуклеотидов и многочисленные вторичные метаболиты1,2. Для всех этих реакций хлоропласты требуют большое количество различных типов белков. Однако хлоропласта геном содержит только около 100 генов3,4. Таким образом хлоропласты необходимо импортировать большинство их белков из цитозоль. В самом деле большинство белков хлоропласта были продемонстрированы быть импортированы из цитозоль после перевода4,5,6. Клетки растений требуют конкретных механизмов для импорта белки из цитозоль в хлоропластах. Однако хотя эти механизмы импорта белка были изучены в течение последних нескольких десятилетий, мы до сих пор не полностью понимаем их на молекулярном уровне. Здесь мы предоставляем подробный метод для подготовки протопласта и экзогенно выражая генов в протопласта. Этот метод может быть ценным для выяснения молекулярные механизмы лежащие в основе белка импорта в хлоропластах в деталях.

Белка импорта могут быть изучены с использованием многих различных подходов. Один из этих методов включает в себя использование в vitro белка импорта7,системы8. Используя этот подход, в пробирке-перевод белка прекурсоров инкубируют с очищенной хлоропластов в пробирке, и белка импорта анализируемой SDS-PAGE, а затем Западный анализ помаркой. Преимуществом этого подхода является, что может подробно каждый шаг белка импорта в хлоропластах. Таким образом этот метод широко используется для определения компонентов молекулярного механизма импорта белка и анализировать сведения о последовательности для транзита пептидов. Совсем недавно был разработан еще один подход с использованием протопласта из листьев тканей, и он стал широко используется для изучения белков импорта в хлоропластах9,10. Преимуществом этого подхода является, что протопласта обеспечивают клеточной среды, которая ближе к нетронутым клеток, чем система, в пробирке . Таким образом система протопластов позволяет нам решать многие дополнительные аспекты этого процесса, например связанные события цитозольной и как определяется специфика ориентации сигналов. Здесь мы представляем подробный протокол для использования протопласта для изучения белков импорта в хлоропластах.

Protocol

1. рост растения арабидопсис Подготовка 1 Л Gamborg B5 (B5) среднего, добавив 3.2 g B5 среды включая витамины, 20 г сахарозы, 0,5 г этана 2-(N-morpholino) сульфоновой кислоты (MES) до приблизительно 800 мл деионизированной воды и скорректировать рН до 5,7 с гидроксидом калия (KOH). Добавить больше деионизирован…

Representative Results

Импорт белков в хлоропластах может проверяться с помощью двух подходов: флуоресцентной микроскопии и immunoblot анализ после разъединения SDS-страницы опосредованной. Здесь, мы использовали БС-nt:GFP, слияние построить кодирования 79 N-терминальный аминокислотных остатков RbcS, …

Discussion

Мы предоставили подробный протокол для использования протопласта Arabidopsis для изучения белков импорта в хлоропластах. Этот метод является мощным для изучения процесса импорта белка. Этот простой, универсальный метод полезен для изучения нападения на предполагаемых грузов белков в…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была проведена с поддерживает программы совместных исследований для сельского развития науки и технологий (проект № PJ010953012018), Управление по развитию сельских районов и Грант Национальный исследовательский фонд (Корея), финансируемого министерством науки и ИКТ (№ 2016R1E1A1A02922014), Республика Корея.

Materials

GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS Duchefa Biochemie G0210.0050
SUCROSE Duchefa Biochemie S0809.5000
MES MONOHYDRATE Duchefa Biochemie M1503.0250
Agar, powder JUNSEI 24440S1201
Micropore Surgical tape 3M 1530-0
Surgical blade stainless No.10 FEATHER Unavailable
Conical Tube, 50ml SPL LIFE SCIENCES 50050
Macerozyme R-10 YAKULT PHARMACEUTICAL IND. Unavailable
Cellulase ONOZUKA R-10 YAKULT PHARMACEUTICAL IND. Unavailable
ALBUMIN, BOVINE (BSA) VWR 0332-100G
D-Mannitol SIGMA M1902-1KG
CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE MP BIOMEDICALS 0219463505-5KG
Twister VISION SCIENTIFIC VS-96TW
Screen cup for CD-1 SIGMA S1145
Screens for CD-1 SIGMA S3895
Petri Dish SPL LIFE SCIENCES 10090
Pasteur pipette HILGENBERG 3150102
LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP VISION SCIENTIFIC VS-5500N
Sodium chloride JUNSEI 19015S0350
Potassium chloride SIGMA P3911-1KG
D-GLUCOSE, ANHYDROUS BIO BASIC GB0219
Potassium Hydroxide DUKSAN 40
Calcium nitrate tetrahydrate SIGMA C2786-500G
Poly(ethylene glycol) SIGMA P2139-2KG
Magnesium chloride hexahydrate SIGMA M2393-500G
Tube 13ml, 100x16mm, PP SARSTEDT 55.515
Microscope slides MARIENFELD 1000412
Microscope Cover Glasses MARIENFELD 101030
Counting Chamber MARIENFELD 650030
Axioplan 2 Imaging Microscope Carl Zeiss Unavailable
Micro tube 1.5ml SARSTEDT 72.690.001
2-Mercaptoethanol SIGMA M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade VWR M107-500G
TRIS, Ultra Pure Grade VWR 0497-5KG
DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade VWR 0281-25G
Bromophenol blue sodium salt ACS VWR 0312-50G
Glycerol JUNSEI 27210S0350
Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) TAKARA 632381

References

  1. Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
  3. Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
  4. Jarvis, P. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).
  5. Li, H. M., Chiu, C. C. Protein Transport into Chloroplasts. Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).
  6. Keegstra, K., Cline, K. Protein import and routing systems of chloroplasts. Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).
  7. Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).
  8. Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments. Cell. 46 (3), 365-375 (1986).
  9. Lee, D. W., et al. Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).
  10. Lee, S., et al. Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).
  11. Jin, J. B., et al. A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).
  12. Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts. Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).
  13. Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts. Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).
  14. Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts. Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).
  15. Lee, J., et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells. Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).
  16. Cleary, S. P., et al. Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).

Play Video

Cite This Article
Lee, J., Kang, H., Hwang, I. Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts. J. Vis. Exp. (142), e58441, doi:10.3791/58441 (2018).

View Video