Summary

Lo studio di proteine importazione in cloroplasti utilizzando protoplasti

Published: December 10, 2018
doi:

Summary

Qui descriviamo un protocollo per esprimere proteine in protoplasti utilizzando il metodo di trasformazione PEG-mediata. Il metodo fornisce facile espressione di proteine di interesse e di indagine efficiente di localizzazione della proteina e il processo di importazione per varie condizioni sperimentali in vivo.

Abstract

Il cloroplasto è un organulo essenziale che è responsabile di vari processi cellulari nelle piante, come la fotosintesi e la produzione di molti metaboliti secondari e di lipidi. Cloroplasti richiedono un gran numero di proteine per questi vari processi fisiologici. Oltre il 95% delle proteine del cloroplasto sono nucleo-codificato e importati in cloroplasti dal cytosol dopo traduzione sui ribosomi citosolici. Così, targeting di queste proteine di nucleo-codificato cloroplasto a cloroplasti o l’importazione corretta è essenziale per il corretto funzionamento di cloroplasti, come pure la cellula della pianta. Nucleo-codificato cloroplasto proteine contengono sequenze di segnale per il targeting specifico di cloroplasti. Macchinario molecolare localizzata al cloroplasto o citosol riconoscere questi segnali ed eseguire il processo di importazione. Per studiare i meccanismi di importazione di proteina o targeting per cloroplasti in vivo, abbiamo sviluppato un metodo basato su protoplasti rapido, efficiente per analizzare la proteina importazione in cloroplasti di Arabidopsis. In questo metodo, usiamo protoplasti isolati dai tessuti fogliari di Arabidopsis. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l’utilizzo di protoplasti per studiare il meccanismo mediante il quale le proteine vengono importate in cloroplasti.

Introduction

Il cloroplasto è uno degli organelli più importanti nelle piante. Una delle funzioni principali dei cloroplasti è di svolgere la fotosintesi1. I cloroplasti svolgono anche molte altre reazioni biochimiche per la produzione di acidi grassi, aminoacidi, nucleotidi e numerosi metaboliti secondari1,2. Per tutte queste reazioni, cloroplasti richiedono un gran numero di diversi tipi di proteine. Tuttavia, il genoma del cloroplasto contiene solo circa 100 geni3,4. Di conseguenza, cloroplasti necessario importare la maggior parte delle loro proteine dal cytosol. Infatti, la maggior parte delle proteine del cloroplasto sono stata indicata per essere importati dal cytosol dopo traduzione4,5,6. Cellule vegetali richiedono meccanismi specifici per l’importazione di proteine dal cytosol ai cloroplasti. Tuttavia, anche se questi meccanismi di importazione di proteina sono stati studiati per i parecchi decenni passati, ancora non completamente capiamo loro a livello molecolare. Qui, forniamo un metodo dettagliato per la preparazione di protoplasti ed esogenicamente che esprimono i geni in protoplasti. Questo metodo potrebbe essere prezioso per chiarire i meccanismi molecolari alla base di importazione di proteina in cloroplasti in dettaglio.

Importazione di proteine possa essere studiati utilizzando molti approcci diversi. Uno di questi metodi prevede l’utilizzo di un in vitro della proteina importazione sistema7,8. Utilizzando questo approccio, in vitro-tradotta proteine precursori vengono incubati con cloroplasti purificata in vitro, e importazione di proteina è analizzata da SDS-PAGE seguita da analisi western blot. Il vantaggio di questo approccio è che ogni passaggio dell’importazione di proteina in cloroplasti possa essere studiata in dettaglio. Pertanto, questo metodo è stato ampiamente utilizzato per definire i componenti del macchinario molecolare della proteina importazione e dissezionare informazioni di sequenza per i peptidi di transito. Più recentemente, è stato sviluppato un altro approccio che coinvolge l’uso dei protoplasti da tessuti fogliari e si è diffuso per lo studio di proteine importazione in cloroplasti9,10. Il vantaggio di questo approccio è che i protoplasti forniscono un ambiente cellulare che è più vicino a quella di cellule intatte rispetto al sistema in vitro . Così, il sistema di protoplasti permette di affrontare molti altri aspetti di questo processo, come gli eventi associati citosolici e come viene determinata la specificità dei segnali di targeting. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l’uso dei protoplasti di studiare proteine importazione in cloroplasti.

Protocol

1. la crescita di piante di Arabidopsis Preparare 1 L Gamborg B5 (B5) medio aggiungendo 3,2 g di B5 medio tra cui vitamine, 20 g di saccarosio, 0,5 g di 2-(N-morpholino) etano acido solfonico (MES) a circa 800 mL di acqua deionizzata e regolare il pH a 5,7 con idrossido di potassio (KOH). Aggiungi più deionizzata acqua portare il volume totale a 1 L. aggiungere 8 g di phytoagar e autoclave per 15 min a 121 ° C. Lasci che il media raffreddare fino a 55 ° C e versare 20 – 25 mL di terreno B5 in una…

Representative Results

L’importazione di proteine in cloroplasti può essere esaminato mediante due approcci: analisi di microscopia e immunoblot di fluorescenza dopo separazione SDS-pagina-mediata. Qui, abbiamo usato RbcS-nt:GFP, una fusione costruire codifica i 79 residui dell’amminoacido N-terminale di RbcS contenente il peptide di transito fuso alla GFP. Quando proteine vengono importate in cloroplasti, i segnali di fluorescenza verde da proteina bersaglio RbcS-nt:GFP dovrebbe fondersi con i segnali fluores…

Discussion

Abbiamo fornito un protocollo dettagliato per l’uso dei protoplasti di Arabidopsis per studiare la proteina importazione in cloroplasti. Questo metodo è potente per studiare il processo di importazione di proteine. Questa tecnica semplice, versatile è utile per esaminare il targeting delle proteine del carico previsto di cloroplasti. Utilizzando questo metodo, protoplasti vengono preparati da tessuti fogliari di Arabidopsis11,12 , che può ess…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato effettuato con il supporto del programma di ricerca cooperativa per la scienza l’agricoltura e lo sviluppo della tecnologia (progetto n ° PJ010953012018), gestione dello sviluppo rurale e la concessione di National Research Foundation (Corea), finanziato dal Ministero della scienza e ICT (n. 2016R1E1A1A02922014), Repubblica di Corea.

Materials

GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS Duchefa Biochemie G0210.0050
SUCROSE Duchefa Biochemie S0809.5000
MES MONOHYDRATE Duchefa Biochemie M1503.0250
Agar, powder JUNSEI 24440S1201
Micropore Surgical tape 3M 1530-0
Surgical blade stainless No.10 FEATHER Unavailable
Conical Tube, 50ml SPL LIFE SCIENCES 50050
Macerozyme R-10 YAKULT PHARMACEUTICAL IND. Unavailable
Cellulase ONOZUKA R-10 YAKULT PHARMACEUTICAL IND. Unavailable
ALBUMIN, BOVINE (BSA) VWR 0332-100G
D-Mannitol SIGMA M1902-1KG
CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE MP BIOMEDICALS 0219463505-5KG
Twister VISION SCIENTIFIC VS-96TW
Screen cup for CD-1 SIGMA S1145
Screens for CD-1 SIGMA S3895
Petri Dish SPL LIFE SCIENCES 10090
Pasteur pipette HILGENBERG 3150102
LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP VISION SCIENTIFIC VS-5500N
Sodium chloride JUNSEI 19015S0350
Potassium chloride SIGMA P3911-1KG
D-GLUCOSE, ANHYDROUS BIO BASIC GB0219
Potassium Hydroxide DUKSAN 40
Calcium nitrate tetrahydrate SIGMA C2786-500G
Poly(ethylene glycol) SIGMA P2139-2KG
Magnesium chloride hexahydrate SIGMA M2393-500G
Tube 13ml, 100x16mm, PP SARSTEDT 55.515
Microscope slides MARIENFELD 1000412
Microscope Cover Glasses MARIENFELD 101030
Counting Chamber MARIENFELD 650030
Axioplan 2 Imaging Microscope Carl Zeiss Unavailable
Micro tube 1.5ml SARSTEDT 72.690.001
2-Mercaptoethanol SIGMA M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade VWR M107-500G
TRIS, Ultra Pure Grade VWR 0497-5KG
DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade VWR 0281-25G
Bromophenol blue sodium salt ACS VWR 0312-50G
Glycerol JUNSEI 27210S0350
Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) TAKARA 632381

References

  1. Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
  3. Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
  4. Jarvis, P. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).
  5. Li, H. M., Chiu, C. C. Protein Transport into Chloroplasts. Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).
  6. Keegstra, K., Cline, K. Protein import and routing systems of chloroplasts. Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).
  7. Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).
  8. Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments. Cell. 46 (3), 365-375 (1986).
  9. Lee, D. W., et al. Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).
  10. Lee, S., et al. Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).
  11. Jin, J. B., et al. A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).
  12. Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts. Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).
  13. Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts. Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).
  14. Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts. Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).
  15. Lee, J., et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells. Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).
  16. Cleary, S. P., et al. Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).

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Cite This Article
Lee, J., Kang, H., Hwang, I. Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts. J. Vis. Exp. (142), e58441, doi:10.3791/58441 (2018).

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