قياس إعادة عرض العظام وإعادة إنشاء بيئة الورم والعظام الدقيقة باستخدام ثقافة كالفاريا المشتركة والقياس الHISTOMORPHometry
Summary
يمكن أن تكون ثقافة الجسم الحي السابق للنباتات العظمية أداة قيمة لدراسة فسيولوجيا العظام والتقييم المحتمل للأدوية في إعادة عرض العظام وأمراض العظام. ويصف البروتوكول المقدم إعداد وثقافة الكلفاريا المعزولة عن جماجم الفئران حديثي الولادة، فضلا عن تطبيقاتها.
Abstract
العظام هي نسيج ضام يتكون من العظام، والعظام، والعظام ومصفوفة معدنية خارج الخلية، مما يعطيها قوتها والمرونة ويسمح لها بالوفاء بوظائفها. يتعرض العظم باستمرار لمجموعة متنوعة من المحفزات ، والتي في الحالات المرضية يمكن أن تؤدي إلى تحرير إعادة عرض العظام. لدراسة بيولوجيا العظام والأمراض وتقييم العوامل العلاجية المحتملة ، كان من الضروري تطوير في المختبر وفي نماذج الجسم الحي.
تصف هذه المخطوطة عملية تشريح الكلفاريا المعزولة عن الفئران الوليدية والظروف الثقافية التي تُعزل عن الفئران الوليدية لدراسة تكوين العظام والبيئة الدقيقة لأورام العظام. على النقيض من نماذج المختبر وفي الجسم الحي ، يسمح هذا النموذج السابق للفحص الحي بالحفاظ على البيئة ثلاثية الأبعاد للأنسجة وكذلك التنوع الخلوي للعظم أثناء الزراعة في ظل ظروف محددة لمحاكاة البيئة الدقيقة المطلوبة. لذلك ، من الممكن التحقق من إعادة عرض العظام وآلياتها ، وكذلك التفاعلات مع أنواع الخلايا الأخرى ، مثل التفاعلات بين الخلايا السرطانية والعظام.
والتجارب ذكرت هنا استخدام calvarias من 5-7 اليوم القديمة BALB / C الفئران. يتم استزراع الهيمي-كالفاريا التي تم الحصول عليها في وجود الأنسولين أو خلايا سرطان الثدي (MDA-MB-231) أو المتوسطة المكيفة من ثقافات خلايا سرطان الثدي. بعد التحليل ، ثبت أن الأنسولين يسبب تكوين العظام الجديدة ، في حين أن الخلايا السرطانية وارتشاف العظام متوسط الحجم. وقد استخدم النموذج الكلوري بنجاح في البحوث الأساسية والتطبيقية لدراسة تطور العظام وأمراض العظام الناجمة عن السرطان. وعموما، بل هو خيار ممتاز لسهولة، ومفيدة، ومنخفضة التكلفة.
Introduction
العظام هي نسيج ضام ديناميكي له عدة وظائف، بما في ذلك دعم العضلات، وحماية الأعضاء الداخلية ونخاع العظام، وتخزين وإطلاق الكالسيوم وعوامل النمو1،2. للحفاظ على سلامتها ووظيفتها السليمة ، فإن أنسجة العظام تخضع باستمرار لعملية إعادة عرض. بشكل عام ، يمكن تقسيم دورة إعادة عرض العظام إلى ارتشاف العظام وتكوين العظام1. يمكن أن يؤدي عدم التوازن بين هاتين المرحلتين من إعادة عرض العظام إلى تطور أمراض العظام. أيضا, أمراض مثل سرطان الثدي غالبا ما تؤثر على سلامة العظام; ما يقرب من 70٪ من المرضى في المراحل المتقدمة لديهم أو سيكون لديهم نقائل العظام. عندما تدخل خلايا سرطان الثدي العظام ، فإنها تؤثر على استقلاب العظام ، مما يؤدي إلى ارتشاف مفرط (آفات العظام) و / أو تشكيل (آفات العظام)3.
لفهم بيولوجيا أمراض العظام وتطوير علاجات جديدة ، من الضروري فهم الآليات التي ينطوي عليها إعادة عرض العظام. في أبحاث السرطان ، من الضروري التحقيق في عملية الانبثاث العظمي وعلاقته بالبيئة الدقيقة النقيلية. في عام 1889 ، افترض ستيفن باجيت أن الانبثاث تحدث عندما يكون هناك توافق بين الخلايا السرطانية والأنسجة المستهدفة ، واقترح أن الموقع النقيلي يعتمد على تقارب الورم للبيئة الدقيقة4. في عام 1997، قدم موندي وغيس مفهوم “الحلقة المفرغة لنقائل العظام” لشرح كيفية تعديل الخلايا السرطانية للبيئة الدقيقة للعظام لتحقيق بقائها والنمو، وكيف تعزز البيئة الدقيقة للعظام نموها من خلال توفير الكالسيوم وعوامل النمو5،6،7.
لتوصيف الآليات المشاركة في إعادة عرض العظام والانبثاث العظام وتقييم الجزيئات مع إمكانات علاجية ممكنة، فقد كان من الضروري لتطوير في المختبر وفي نماذج الجسم الحي. ومع ذلك ، فإن هذه النماذج تقدم حاليا العديد من القيود ، مثل التمثيل المبسط للبيئة الدقيقة للعظام ، وتكلفتها8،9. ثقافة العظام explants السابقين في الجسم الحي لديه ميزة الحفاظ على منظمة ثلاثية الأبعاد، فضلا عن تنوع خلايا العظام. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التحكم في الظروف التجريبية. نماذج explant تشمل ثقافة عظام مشط القدم، رؤساء الفخذ، calvarias، والنوى الفك السفلي أو trabecular10. وقد تم إثبات مزايا نماذج الجسم الحي السابقين في دراسات متنوعة. في عام 2009 ، ذكرت Nordstrand والمتعاونين إنشاء نموذج الثقافة المشتركة على أساس التفاعلات بين خلايا سرطان العظام والبروستاتا11. أيضا، في عام 2012، أفاد كورتين والمتعاونين تطوير نموذج ثلاثي الأبعاد باستخدام ex vivo cocultures12. والغرض من هذه النماذج الجسم الحي السابق هو إعادة ظروف البيئة الدقيقة العظام بأكبر قدر ممكن من الدقة لتكون قادرة على توصيف الآليات المشاركة في إعادة عرض العظام العادية أو المرضية وتقييم فعالية العوامل العلاجية الجديدة.
ويستند البروتوكول الحالي إلى الإجراءات التي نشرها غاريت13 ومحمد وآخرون14. وقد استخدمت ثقافات كالفاريا الفأر الوليدية كنموذج تجريبي، لأنها تحتفظ بالهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد للعظم قيد التطوير والخلايا العظمية، بما في ذلك الخلايا في جميع مراحل التمايز (أي العظام، والعظام، والخلايا العظمية، والخلايا النجمية) التي تؤدي إلى العظام الناضجة والعظام، فضلا عن المصفوفة المعدنية14. نموذج الجسم الحي السابق لا يمثل العملية المرضية لأمراض العظام تماما. ومع ذلك، يمكن قياس الآثار على إعادة عرض العظام أو انسياب العظام الناجم عن السرطان بدقة.
وباختصار ، يتكون هذا البروتوكول من الخطوات التالية : تشريح calvarias من الفئران القديمة 5-7 أيام ، calvaria preculture ، تطبيقات ثقافة calvaria (على سبيل المثال ، الثقافة في وجود الأنسولين والخلايا السرطانية أو المتوسطة مكيفة ، وحتى وكلاء مع الإمكانات العلاجية ، وفقا لهدف التحقيق) ، تثبيت العظام وإزالة الكلس ، معالجة الأنسجة ، التحليل النسيجي ، وتفسير النتائج.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، ونحن نصف بروتوكول لنموذج الجسم الحي السابق calvari لتقييم تكوين العظام أو ارتشاف ودراسة تفاعلات الخلايا السرطانية مع عظم الفأر ة calvarial. الخطوات الحاسمة لهذه التقنية هي تشريح ، والثقافة ، والتضمين ، وتحليل الكالفتريا. خلال تشريح الكالفاريات ، من الأهمية بمكان قطع الهيمي -كالفاريا إ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون ماريو نومورا، دكتوراه في الطب ورودولفو دياز لمساعدتهم في علم الأنسجة، وبييرك فورنييه، دكتوراه لتعليقاته القيمة لتحسين نوعية الورقة.
Materials
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
- Boyce, B., Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. Bone biology and pathology. Handbook of Cancer-Related Bone Disease. , 3-21 (2012).
- Clark, R. K. . Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, (2005).
- Fournier, P. G. J., Juárez, P., Guise, T. A., Heymann, D. Tumor-bone interactions: there is no place like bone. Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. , 13-28 (2014).
- Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. Stephen Paget and the “seed and soil” theory of metastatic dissemination. Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).
- Guise, T. A. The vicious cycle of bone metastases. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).
- Mundy, G. R. Mechanisms of bone metastasis. Cancer. 80 (8), 1546-1556 (1997).
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).
- Chong, S. K. M. Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy. Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).
- Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).
- Nordstrand, A., et al. Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells. Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).
- Garret, R., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures. Bone Research Protocols. , 183-198 (2003).
- Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures. Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).
