利用卡尔瓦里亚共同培养和教条法测量骨重塑和再造肿瘤-骨微环境
Summary
骨外植物的外生培养是骨生理学研究的宝贵工具，是骨改和骨病药物的潜在评价。提交的协议描述了从新生小鼠头骨分离的钙瓦里亚的制备和培养及其应用。
Abstract
骨骼是由成骨细胞、骨细胞和成骨细胞组成的结缔组织，是一种成矿的细胞外基质，赋予其强度和灵活性，使其能够履行其功能。骨骼不断受到各种刺激，在病理条件下可以放松对骨重塑的调节。为了研究骨生物学和疾病，并评估潜在的治疗药物，有必要开发体外和体内模型。
本稿描述了从新生儿小鼠分离的钙质的解剖过程和培养条件，以研究骨骼形成和骨肿瘤微环境。与体外和体内模型不同，这种前活体模型允许保存组织的三维环境以及骨骼的细胞多样性，同时在规定的条件下进行培养以模拟所需的微环境。因此，可以研究骨重塑及其机制，以及与其他细胞类型的相互作用，如癌细胞和骨骼之间的相互作用。
这里报告的测定使用5-7天大的BALB/C小鼠的钙瓦里。获得的中度钙瓦解是在存在胰岛素、乳腺癌细胞（MDA-MB-231）或乳腺癌细胞培养物的调节介质的情况下培养的。经分析，确定胰岛素诱发新的骨骼形成，而癌细胞及其条件介质诱发骨吸收。钙质模型已成功应用于基础和应用研究，研究骨骼发育和癌症诱发的骨病。总体而言，它是简单、信息丰富、低成本测定的绝佳选择。
Introduction
骨骼是一种动态的结缔组织，具有多种功能，包括支持肌肉，保护内脏器官和骨髓，储存和释放钙和生长因子11，2。2为了保持其完整性和功能，骨组织不断进行重塑。一般来说，骨重塑的周期可以分为骨吸收和骨骼形成1。骨重塑这两个阶段之间的不平衡可能导致骨病理学的发展。此外，乳腺癌等疾病通常影响骨骼完整性;大约70%以上的晚期患者有或将有骨转移。当乳腺癌细胞进入骨骼时，它们影响骨骼代谢，导致过度再吸收（骨质病变）和/或形成（骨质病变）3。
要了解骨病的生物学，开发新的治疗方法，必须了解骨重塑所涉及的机制。在癌症研究中，研究骨转移过程及其与转移微环境的关系至关重要。1889年，Stephen Paget假设当肿瘤细胞和目标组织之间存在相容性时就会发生转移，并建议转移位点取决于肿瘤对微环境4的亲和力。1997年，蒙迪和吉斯引入了”骨转移的恶性循环”的概念，以解释肿瘤细胞如何改变骨微环境以实现其生存和生长，以及骨微环境如何通过提供钙和生长因子55、6、76,7来促进其生长。
为了描述骨重塑和骨转移所涉及的机制，并评估具有潜在治疗潜力的分子，有必要在体外和体内培养模型。然而，这些模型目前存在许多限制，如骨微环境的简化表示，其成本88，9。9骨外植物外植物的培养具有保持三维组织以及骨细胞多样性的优点。此外，可以控制实验条件。外植模型包括骨骼、股骨头、钙质体和颌骨或纹芯10的培养。在不同研究中，前活体模型的优点得到了证明。2009年，Nordstrand和合作者报告说，建立了基于骨癌和前列腺癌细胞11相互作用的共同培养模型。此外，在2012年，Curtin和合作者报告说，使用外野共同培养12的三维模型的发展。这种前活体模型的目的是尽可能准确地重现骨微环境的条件，以便能够描述正常或病理性骨重塑所涉及的机制，并评估新的治疗剂的疗效。
本议定书以加勒特13和穆罕默德等人14日公布的程序为基础。新生儿小鼠钙质培养物已被用作实验模型，因为它们保留了发育中的骨骼和骨细胞的三维结构，包括分化所有阶段的细胞（即成细胞、成骨细胞、骨细胞、基质细胞），这些细胞导致成熟成骨细胞和成骨细胞，以及矿化基质14。前活体模型并不完全代表骨病的病理过程。然而，对骨骼重塑或癌症引起的骨裂的影响可以准确测量。
简而言之，该协议包括以下步骤：从5-7天大小鼠的钙质解剖，钙质预培养，钙质培养应用（例如，在胰岛素存在培养，癌细胞或中等，甚至剂与治疗潜力，根据调查的目的），骨固定和钙质化贴花，组织处理，组织分析，结果解释。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们描述了计算骨骼形成或吸收以及研究癌细胞与钙质小鼠骨骼相互作用的钙质前活体模型的协议。该技术的关键步骤是钙质的解剖、培养、嵌入和形态学分析。在解剖钙质时，将半部钙质切成梯形至关重要，因为它将有力地促进石蜡加入过程中的方向。在研究癌细胞与钙质的相互作用时，使用未为细胞培养治疗的多孔板来防止癌细胞粘附和生长在塑料上而不是骨头上是很重要的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢马里奥·野村、医学博士和鲁道夫·迪亚斯在《本体学》方面的帮助，以及皮耶里克·富尼尔博士为提高论文质量而提出的宝贵意见。
Materials
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
- Boyce, B., Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. Bone biology and pathology. Handbook of Cancer-Related Bone Disease. , 3-21 (2012).
- Clark, R. K. . Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, (2005).
- Fournier, P. G. J., Juárez, P., Guise, T. A., Heymann, D. Tumor-bone interactions: there is no place like bone. Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. , 13-28 (2014).
- Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. Stephen Paget and the “seed and soil” theory of metastatic dissemination. Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).
- Guise, T. A. The vicious cycle of bone metastases. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).
- Mundy, G. R. Mechanisms of bone metastasis. Cancer. 80 (8), 1546-1556 (1997).
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).
- Chong, S. K. M. Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy. Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).
- Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).
- Nordstrand, A., et al. Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells. Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).
- Garret, R., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures. Bone Research Protocols. , 183-198 (2003).
- Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures. Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).
