Misurare il rimodellamento osseo e ricreare il microambiente tumore-osso utilizzando la co-cultura Calvaria e l'ibitorometria
Summary
La coltura ex vivo degli espianti ossei può essere uno strumento prezioso per lo studio della fisiologia ossea e la potenziale valutazione dei farmaci nel rimodellamento osseo e nelle malattie ossee. Il protocollo presentato descrive la preparazione e la cultura delle calvarias isolate dai crani dei topi neonati, nonché le sue applicazioni.
Abstract
L’osso è un tessuto connettivo costituito da osteoblasti, osteociti e osteoclasti e una matrice extracellulare mineralizzata, che gli conferisce la sua forza e flessibilità e gli permette di svolgere le sue funzioni. L’osso è continuamente esposto a una varietà di stimoli, che in condizioni patologiche possono deregolare il rimodellamento osseo. Per studiare biologia e malattie ossee e valutare potenziali agenti terapeutici, è stato necessario sviluppare modelli in vitro e in vivo.
Questo manoscritto descrive il processo di dissezione e le condizioni di coltura dei calvarias isolati dai topi neonemici per studiare la formazione ossea e il microambiente tumorale osseo. A differenza dei modelli in vitro e in vivo, questo modello ex vivo consente la conservazione dell’ambiente tridimensionale del tessuto e della diversità cellulare dell’osso durante la coltura in condizioni definite per simulare il microambiente desiderato. Pertanto, è possibile studiare il rimodellamento osseo e i suoi meccanismi, nonché le interazioni con altri tipi di cellule, come le interazioni tra cellule tumorali e ossa.
I saggi qui riportati usano calvarias da topi BALB/C di 5-7 giorni. Le emi-calvarias ottenute sono coltivate in presenza di insulina, cellule del cancro al seno (MDA-MB-231), o mezzo condizionato dalle colture di cellule del cancro al seno. Dopo l’analisi, è stato stabilito che l’insulina ha indotto nuova formazione ossea, mentre le cellule tumorali e il loro rinnovano osseo medio condizionato. Il modello calvariale è stato utilizzato con successo nella ricerca di base e applicata per studiare lo sviluppo osseo e le malattie ossee indotte dal cancro. Nel complesso, è un’opzione eccellente per un saggio facile, informativo e a basso costo.
Introduction
L’osso è un tessuto connettivo dinamico che ha diverse funzioni, tra cui sostenere i muscoli, proteggere gli organi interni e il midollo osseo, e immagazzinare e rilasciare calcio e fattori di crescita1,2. Per mantenere la sua integrità e la corretta funzione, il tessuto osseo è continuamente sotto il processo di rimodellamento. In termini generali, un ciclo di rimodellamento osseo può essere diviso in risorsurare l’osso e la formazione ossea1. Uno squilibrio tra queste due fasi di rimodellamento osseo può portare allo sviluppo di patologie ossee. Inoltre, malattie come il cancro al seno spesso influenzano l’integrità ossea; circa il 70% dei pazienti in stadi avanzati ha o avrà metastasi ossee. Quando le cellule del cancro al seno entrano nelle ossa, influenzano il metabolismo osseo, con conseguente eccessiva riinstallazione (lesioni osteoclastiche) e/o formazione (lesioni osteoblastiche)3.
Per comprendere la biologia delle malattie ossee e sviluppare nuovi trattamenti, è necessario comprendere i meccanismi coinvolti nel rimodellamento osseo. Nella ricerca sul cancro, è essenziale studiare il processo di metastasi ossea e la sua relazione con il microambiente metastatico. Nel 1889, Stephen Paget ipotizzò che le metastasi si verificano quando c’è compatibilità tra le cellule tumorali e il tessuto bersaglio, e suggerì che il sito metastatico dipende dall’affinità del tumore per il microambiente4. Nel 1997, Mundy e Guise hanno introdotto il concetto di “circolo vizioso delle metastasi ossee” per spiegare come le cellule tumorali modificano il microambiente osseo per raggiungere la loro sopravvivenza e crescita, e come il microambiente osseo promuove la loro crescita fornendo fattori di calcio e crescita5,6,7.
Per caratterizzare i meccanismi coinvolti nel rimodellamento osseo e nella metastasi ossea e per valutare le molecole con un possibile potenziale terapeutico, è stato necessario sviluppare modelli in vitro e in vivo. Tuttavia, questi modelli presentano attualmente molte limitazioni, come la rappresentazione semplificata del microambiente osseo, e il loro costo8,9. La coltura degli espiatori ossei ex vivo ha il vantaggio di mantenere l’organizzazione tridimensionale e la diversità delle cellule ossee. Inoltre, le condizioni sperimentali possono essere controllate. I modelli espiantanti includono la coltura delle ossa metatarsale, teste femorali, calvarias, e nuclei mandibolari o trabecolari10. I vantaggi dei modelli ex vivo sono stati dimostrati in diversi studi. Nel 2009, Nordstrand e collaboratori hanno riferito l’istituzione di un modello di cocultura basato sulle interazioni tra le cellule tumorali ossee e prostata11. Inoltre, nel 2012, Curtin e collaboratori hanno riportato lo sviluppo di un modello tridimensionale utilizzando coculture ex vivo 12. Lo scopo di tali modelli ex vivo è quello di ricreare le condizioni del microambiente osseo nel modo più accurato possibile per poter caratterizzare i meccanismi coinvolti nel normale o patologico rimodellamento osseo e valutare l’efficacia di nuovi agenti terapeutici.
Il presente protocollo si basa sulle procedure pubblicate da Garrett13 e Mohammad etal. Le colture neovari chevariate di calvaria topo sono state utilizzate come modello sperimentale, in quanto conservano l’architettura tridimensionale dell’osso in fase di sviluppo e cellule ossee, comprese le cellule in tutte le fasi di differenziazione (cioè osteoblasti, osteoclasti, osteociti, cellule stromali) che portano a osteoclasti maturi e osteoblasti, nonché alla matrice minerale14. Il modello ex vivo non rappresenta totalmente il processo patologico delle malattie ossee. Tuttavia, gli effetti sul rimodellamento osseo o sull’osteolisi ossea indotta dal cancro possono essere misurati con precisione.
In breve, questo protocollo consiste nei seguenti passaggi: la dissezione dei calvarias da topi vecchi di 5-7 giorni, precoltura calvaria, applicazioni di coltura calvaria (ad esempio, coltura in presenza di insulina, cellule tumorali o mezzi condizionati, e persino agenti con potenziale terapeutico, secondo lo scopo dell’indagine), fissazione ossea e decalcificazione calvaria, elaborazione dei tessuti, analisi istologica e interpretazione dei risultati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo il protocollo per un modello di ex vivo calvariale per valutare la formazione o il risurrezione ossea e per studiare le interazioni delle cellule tumorali con l’osso cavariale del topo. I passaggi critici di questa tecnica sono la dissezione, la cultura, l’incorporamento e l’analisi istomormetrica dei calvarias. Durante la dissezione delle calvarias, è fondamentale tagliare le emi-calvarias in un trapezio, in quanto faciliterà fortemente l’orientamento durante l’inclusione della paraffina. Qua…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Mario Nomura, M.D. e Rodolfo Daaz per il loro aiuto con l’istologia, e Pierrick Fournier, Ph.D. per i suoi preziosi commenti per migliorare la qualità della carta.
Materials
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
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