Messung der Knochenumgestaltung und Nachbildung der Tumor-Knochen-Mikroumgebung mit Calvaria-Kokultur und Histomorphometrie
Summary
Die Ex-vivo-Kultur von Knochenexplanten kann ein wertvolles Werkzeug für die Erforschung der Knochenphysiologie und die mögliche Bewertung von Medikamenten bei Knochenremodellierung und Knochenerkrankungen sein. Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Vorbereitung und Kultur von Calvarias, die aus neugeborenen Mäuseschädeln isoliert sind, sowie deren Anwendungen.
Abstract
Knochen ist ein Bindegewebe aus Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten und einer mineralisierten extrazellulären Matrix, die ihm seine Stärke und Flexibilität verleiht und es ihm ermöglicht, seine Funktionen zu erfüllen. Knochen sind kontinuierlich einer Vielzahl von Reizen ausgesetzt, die unter pathologischen Bedingungen den Knochenumbau deregulieren können. Um Knochenbiologie und Krankheiten zu untersuchen und potenzielle therapeutische Wirkstoffe zu bewerten, war es notwendig, In-vitro- und In-vivo-Modelle zu entwickeln.
Dieses Manuskript beschreibt den Sezierensprozess und die Kulturbedingungen von Calvarias, die von neonatalen Mäusen isoliert wurden, um die Knochenbildung und die Mikroumgebung des Knochentumors zu untersuchen. Im Gegensatz zu In-vitro- und In-vivo-Modellen ermöglicht dieses Ex-vivo-Modell die Erhaltung der dreidimensionalen Umgebung des Gewebes sowie der zellulären Vielfalt des Knochens während der Kultivierung unter definierten Bedingungen, um die gewünschte Mikroumgebung zu simulieren. Daher ist es möglich, Knochen-Remodeling und seine Mechanismen zu untersuchen, sowie die Wechselwirkungen mit anderen Zelltypen, wie die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und Knochen.
Die hier berichteten Assays verwenden Calvarien von 5-7 Tage alten BALB/C-Mäusen. Die erhaltenen Hemi-Calvarien werden in Gegenwart von Insulin, Brustkrebszellen (MDA-MB-231) oder konditionierten Medien aus Brustkrebszellkulturen kultiviert. Nach der Analyse wurde festgestellt, dass Insulin eine neue Knochenbildung induzierte, während Krebszellen und ihre konditionierte mittelinduzierte Knochenresorption. Das kalvariale Modell wurde erfolgreich in der Grundlagen- und angewandten Forschung eingesetzt, um knochenentwicklung und krebsinduzierte Knochenerkrankungen zu untersuchen. Insgesamt ist es eine ausgezeichnete Option für einen einfachen, informativen und kostengünstigen Assay.
Introduction
Knochen ist ein dynamisches Bindegewebe, das mehrere Funktionen hat, einschließlich der Unterstützung der Muskeln, Schutz der inneren Organe und Knochenmark, und Speicherung und Freisetzung von Kalzium und Wachstumsfaktoren1,2. Um seine Integrität und die ordnungsgemäße Funktion zu erhalten, wird Knochengewebe kontinuierlich umgebaut. Im Allgemeinen kann ein Zyklus der Knochenumgestaltung in Knochenresorption und Knochenbildung1unterteilt werden. Ein Ungleichgewicht zwischen diesen beiden Phasen des Knochenumbaus kann zur Entwicklung von Knochenpathologien führen. Auch Krankheiten wie Brustkrebs beeinflussen oft die Knochenintegrität; etwa 70% der Patienten im fortgeschrittenen Stadium haben oder werden Knochenmetastasen haben. Wenn Brustkrebszellen in die Knochen gelangen, beeinflussen sie den Knochenstoffwechsel, was zu einer übermäßigen Resorption (osteoklastische Läsionen) und/oder Bildung (osteoblastische Läsionen)3führt.
Um die Biologie von Knochenerkrankungen zu verstehen und neue Behandlungen zu entwickeln, ist es notwendig, die Mechanismen zu verstehen, die mit dem Umbau von Knochen verbunden sind. In der Krebsforschung ist es wichtig, den Knochenmetastasierungsprozess und seine Beziehung zur metastasierenden Mikroumgebung zu untersuchen. Im Jahre 1889 vermutete Stephen Paget, dass Metastasen auftreten, wenn es Kompatibilität zwischen den Tumorzellen und dem Zielgewebe gibt, und schlug vor, dass die metastasierende Stelle von der Affinität des Tumors für die Mikroumgebung abhängt4. 1997 führten Mundy und Guise das Konzept des “bösartigen Zyklus von Knochenmetastasen” ein, um zu erklären, wie Tumorzellen die Mikroumgebung des Knochens verändern, um ihr Überleben und Wachstum zu erreichen, und wie die Knochenmikroumgebung ihr Wachstum fördert, indem sie Kalzium und Wachstumsfaktoren5,6,7zur Verfügung stellt.
Um die Mechanismen der Knochenumgestaltung und Knochenmetastasierung zu charakterisieren und Moleküle mit möglichem therapeutischen Potenzial zu bewerten, war es notwendig, In-vitro- und In-vivo-Modelle zu entwickeln. Diese Modelle stellen jedoch derzeit viele Einschränkungen dar, wie z. B. die vereinfachte Darstellung der Knochenmikroumgebung und deren Kosten8,9. Die Kultur der Knochenexplantationen ex vivo hat den Vorteil, dass die dreidimensionale Organisation sowie die Vielfalt der Knochenzellen erhalten bleiben. Darüber hinaus können experimentelle Bedingungen kontrolliert werden. Die Explant-Modelle umfassen die Kultur der metatarsalen Knochen, Femoralköpfe, Calvarias und Unterkiefer- oder Trabekulularkerne10. Die Vorteile der ex vivo-Modelle wurden in verschiedenen Studien nachgewiesen. Im Jahr 2009 berichteten Nordstrand und Mitarbeiter über die Einrichtung eines Cokulturmodells, das auf den Wechselwirkungen zwischen Knochen- und Prostatakrebszellen basiert11. Auch im Jahr 2012 berichteten Curtin und Mitarbeiter über die Entwicklung eines dreidimensionalen Modells mit Ex-vivo-Kokulturen 12. Der Zweck solcher Ex-vivo-Modelle ist es, die Bedingungen der Knochenmikroumgebung so genau wie möglich neu zu erstellen, um die Mechanismen zu charakterisieren, die bei der normalen oder pathologischen Knochenumgestaltung beteiligt sind, und die Wirksamkeit neuer therapeutischer Wirkstoffe zu bewerten.
Das vorliegende Protokoll basiert auf den von Garrett13 und Mohammad et al.14veröffentlichten Verfahren. Neonatale Maus-Calvaria-Kulturen wurden als experimentelles Modell verwendet, da sie die dreidimensionale Architektur des Knochens in Entwicklung und Knochenzellen beibehalten, einschließlich Zellen in allen Stadien der Differenzierung (d.h. Osteoblasten, Osteoklasten, Osteozyten, Stromalzellen), die zu reifen Osteoklasten und Osteoblasten führen, sowie die mineralisierte Matrix14. Das ex vivo-Modell stellt den pathologischen Prozess von Knochenerkrankungen nicht vollständig dar. Die Auswirkungen auf den Knochenumbau oder die krebsinduzierte Knochenosteolyse können jedoch genau gemessen werden.
Kurz gesagt, besteht dieses Protokoll aus den folgenden Schritten: die Zerlegung von Calvarias von 5-7 Tage alten Mäusen, Calvaria-Präkultur, Calvaria-Kulturanwendungen (z. B. Kultur in Gegenwart von Insulin, Krebszellen oder konditioniertem Medium, und sogar Wirkstoffe mit therapeutisches Potenzial, entsprechend dem Ziel der Untersuchung), Knochenfixierung und Calvaria-Entkalkung, Gewebeverarbeitung, histologische Analyse und Ergebnisinterpretation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir das Protokoll für ein kalvariales Ex-vivo-Modell zur Bewertung der Knochenbildung oder -resorption und zur Untersuchung der Wechselwirkungen von Krebszellen mit kalvarialen Mausknochen. Die entscheidenden Schritte dieser Technik sind die Zerlegung, Kultur, Einbettung und histomorphometrische Analyse der Calvarias. Während der Zerlegung der Calvarien ist es entscheidend, die Hemi-Calvarien in ein Trapez zu schneiden, da es die Orientierung während der Paraffinaufnahme stark erleichtert. Be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Mario Nomura, M.D. und Rodolfo D’az für ihre Hilfe bei der Histologie, und Pierrick Fournier, Ph.D. für seine wertvollen Kommentare zur Verbesserung der Qualität des Papiers.
Materials
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
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