Halbautomatische PD-L1-Charakterisierung und Aufzählung zirkulierender Tumorzellen von nicht-kleinen Lungenkrebspatienten durch Immunfluoreszenz

Summary

Die Charakterisierung zirkulierender Tumorzellen (CTCs) ist ein beliebtes Thema in der translationalen Forschung. Dieses Protokoll beschreibt einen halbautomatischen Immunfluoreszenztest (IF) zur PD-L1-Charakterisierung und Aufzählung von CTCs in Nicht-Kleinzell-Lungenkrebsproben (NSCLC).

Abstract

Zirkulierende Tumorzellen (CTCs), die aus dem Primärtumor abgeleitet werden, werden in den Blutkreislauf oder das Lymphsystem vergossen. Diese seltenen Zellen (1,10 Zellen pro ml Blut) garantieren eine schlechte Prognose und korrelieren mit einem kürzeren Gesamtüberleben bei mehreren Krebsarten (z. B. Brust, Prostata und Dickdarmkrebs). Derzeit ist das Anti-EpCAM-beschichtete magnetische Perlen-basierte CTC-Erfassungssystem der Goldstandard-Test, der von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) für die Aufzählung von CTCs im Blutkreislauf zugelassen wurde. Dieser Test basiert auf der Verwendung von magnetischen Perlen, die mit Anti-EpCAM-Markern beschichtet sind, die speziell epitheliale Krebszellen aufvisieren. Viele Studien haben gezeigt, dass EpCAM nicht der optimale Marker für die CTC-Erkennung ist. Tatsächlich sind CTCs eine heterogene Subpopulation von Krebszellen und können sich einem epitheliaal-mesenchymalen Übergang (EMT) unterziehen, der mit metastasierender Proliferation und Invasion verbunden ist. Diese CTCs sind in der Lage, die Expression des Zelloberflächenepithelmarkers EpCAM zu reduzieren und gleichzeitig mesenchymale Marker wie Vimentin zu erhöhen. Um diese technische Hürde zu überwinden, wurden andere Isolationsmethoden entwickelt, die auf physikalischen Eigenschaften von CTCs basieren. Mikrofluidische Technologien ermöglichen einen etikettenfreien Ansatz zur CTC-Anreicherung aus Vollblutproben. Die spiralförmige mikrofluidische Technologie nutzt die Trägheits- und Dean-Drag-Kräfte mit kontinuierlichem Fluss in gekrümmten Kanälen, die in einem spiralförmigen mikrofluidischen Chip erzeugt werden. Die Zellen werden aufgrund der Unterschiede in Größe und Plastizität zwischen normalen Blutzellen und Tumorzellen getrennt. Dieses Protokoll beschreibt die verschiedenen Schritte zur Charakterisierung des programmierten Death-Ligand 1 (PD-L1)-Ausdrucks von CTCs, indem ein spiralförmiges mikrofluidisches Gerät mit anpassbarem Immunfluoreszenz-Marker (IF) kombiniert wird.

Introduction

Tumorantigen-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) spielen eine entscheidende Rolle bei der Reaktion auf Krebs erkrankungen durch einen Prozess, der als Krebs “Immunüberwachung” bekannt ist. Ihre Anti-Tumor-Funktionen werden durch Immun-Checkpoint-Blockade-Antikörper wie CTLA-4-Hemmer und PD-1/PD-L1-Hemmer verstärkt. Bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) führen Anti-PD-1/PD-L1-Therapien zu Ansprechraten zwischen 0%-17% bei Patienten mit PD-L1-negativen Tumoren und 36%-100% bei Patienten, die PD-L1 exemittieren. Die robusten Reaktionen auf die PD-1/PD-L1-Blockade, die bei Melanomen und NSCLC beobachtet wurden, zeigen Hinweise auf eine verbesserte Gesamtansprechrate (RR), dauerhafte klinische Vorteile und progressionsfreies Überleben (PFS). Derzeit sind Anti-PD1-Behandlungen der Standard der Behandlung in der zweiten Linie NSCLC-Behandlung mit Nivolumab unabhängig von der PD-L1-Expression und mit Pembrolizumab bei Patienten, die PD-L1-1% exdrücken. In der Erstlinienbehandlung ist der Standard der Behandlung Pembrolizumab allein bei Patienten mit NSCLC, die PD-L1 exdrücken, 50 % undkann potenziell mit Chemotherapie (Platin und Doublet-Medikament je nach histologischem Subtyp) 1^,2verbessert werden.

Ein solcher Ansatz für das Patientenmanagement ist jedoch fraglich³, da die PD-L1-Expression in Tumorzellen durch Immunhistochemie (IHC) wahrscheinlich nicht der ideale Begleitbiomarker ist. Andere wie Tumormutationsbelastung⁴ (TMB), Mikrosatelliteninstabilität (MSI) und/oder Mikrobiota sind in dieser Umgebung möglicherweise allein oder in Kombination interessant. NSCLC sind als heterogene Tumoren bekannt, entweder räumlich (von einer Tumorstelle zu einer anderen) oder zeitlich (von der Diagnose bis zum Wiederauftreten). Patienten mit NSCLC sind in der Regel zerbrechlich, und iterative invasive Gewebebiopsien können ein Problem sein. Tatsächlich liegt die Rebiopsierate bei der ersten Progression je nach Serie zwischen 46 und 84 %, und die erfolgreiche Rebiopsie (d. h. mit histologischer und vollständigmolekularer Analyse) liegt zwischen 33%-75%. Dies bedeutet, dass 25%-67% der Patienten während der ersten Progression keine umfassende Rebiopsieanalyse erhalten können^5,6,7,8.

Das Aufkommen von “flüssigen Biopsien” hat daher in diesem speziellen Umfeld erhebliche Begeisterung ausgelöst, da es eine entscheidende Neubewertung molekularer Veränderungen während der Krankheitsprogression ermöglicht, indem zirkulierende freie DNA (cfDNA) untersucht wird, die aus zirkulierender DNA (cfDNA) gewonnen wird. Tumorzellen (CTCs). Diese lebenden Zellen werden aus dem Tumor in den Blutkreislauf freigesetzt, wo sie frei zirkulieren. Obwohl sie nicht routinemäßig verwendet wird, scheint die Analyse von CTCs bei molekularer und phänotypischer Charakterisierung, Prognose und prädiktiver Bedeutung bei Lungenkrebs (über DNAseq, RNAseq, miRNA und Proteinanalyse) sehr vielversprechend zu sein. Tatsächlich enthalten CTCs wahrscheinlich eher phänotypische Merkmale der aktiven Krankheit als die anfänglichen Marker (die bei der Diagnose auf Gewebebiopsien nachgewiesen wurden). Darüber hinaus umgehen CTCs das Problem der räumlichen Heterogenität des Tumorgewebes, das bei kleinen Biopsien ein entscheidendes Problem sein kann. Folglich kann die PD-L1-Expression auf CTCs möglicherweise Licht auf die Diskrepanzen werfen, die sich aus seiner Verwendung als prädiktiver Biomarker unter Verwendung von Tumorgewebe ergeben.

Kürzlich wurde die PD-L1-Expression in CTCs von NSCLC getestet. Fast alle der getesteten^{Patienten waren} PD-L1-positiv, was die Interpretation des Ergebnisses und seine klinische Anwendung erschwerte. Insgesamt wurden PD-L1-positive CTCs in 69,4% der Proben von durchschnittlich 4,5 Zellen/ml¹⁰nachgewiesen. Nach Beginn der Strahlentherapie stieg der Anteil der PD-L1-positiven CTCs signifikant an, was auf eine Upregulation der PD-L1-Expression als Reaktion auf Strahlung¹¹hindeutet. Daher kann die PD-L1-CTCs-Analyse verwendet werden, um dynamische Veränderungen des Tumors und der Immunantwort zu überwachen, die die Reaktion auf Chemotherapie, Bestrahlung und wahrscheinliche Immuntherapie (IT) Behandlungen widerspiegeln können.

Bis heute basieren ctCs Isolation und PD-L1-Charakterisierung auf verschiedene Methoden wie Anti-EpCAM-beschichtete magnetische Perlen-basierte CTC-Erfassung, anreicherungsfreie Assay und größenbasierte^12,13 CTC-Capture-Assays. CTCs wurden jedoch nur bei 45%-65% der Patienten mit metastasierendem NSCLC nachgewiesen, wodurch ihre Fähigkeit, Informationen für mehr als die Hälfte der metastasierenden NSCLC-Patienten bereitzustellen, eingeschränkt wurde. Darüber hinaus war die CTC-Zahl in den meisten dieser Studien mit größenbasiertem Ansatz¹⁰niedrig. Darüber hinaus hat diese Methode zu Diskrepanzen wie dem Nachweis von CD45(-)/DAPI(+)-Zellen mit “zytomorphologischen Mustern der Malignität” im Blut von gesunden Spendern geführt. Diese Bedenken unterstreichen die Notwendigkeit einer hochsensiblen Methode der CTC-Sammlung im Zusammenhang mit der Immun-Phänotypisierung atypischer CD45(-)-Zellen aus gesundem Vollblut mit zusätzlichen Krebsbiomarkern (z. B. TTF1, Vimentin, EpCAM und CD44) in NSCLC.

Folglich haben wir ein spiralmikrofluidisches Gerät ausgewertet, das Trägheits- und Dean-Drag-Kräfte verwendet, um Zellen basierend auf Größe und Plastizität durch einen mikrofluidischen Chip zu trennen. Die Bildung von Dean Wirbelflüssen, die im mikrofluidischen Chip vorhanden sind, führt zu größeren CTCs entlang der Innenwand und kleineren Immunzellen entlang der Außenwand des Chips. Der Anreicherungsprozess wird durch Absaugen der größeren Zellen in den Entnahmeauslass als angereicherte CTC-Fraktion abgeschlossen. Diese Methode ist besonders empfindlich und spezifisch (Nachweis von ca. 1 CTC/ml Vollblut)¹⁴ und kann mit kundenspezifischen Immunfluoreszenzanalysen (IF) in Verbindung gebracht werden. Diese Instrumente werden es ermöglichen, einen positiven Schwellenwert für die klinische Interpretation festzulegen. So wird ein Workflow beschrieben, der es Biologen ermöglicht, CTCs mit hoher Regenerationsrate und Spezifität zu isolieren und immunphenotyp. Das Protokoll beschreibt die optimale Nutzung des spiralförmigen mikrofluidischen Geräts zur Erfassung von CTCs, die optimierten IF-Assays, die je nach Krebsart angepasst werden können, und die Verwendung kostenloser Open-Source-Software zur Messung und Analyse von Zellbildern zur Durchführung einer halbautomatischen Zählung der Zellen nach fluoreszierender Färbung. Darüber hinaus kann das Mikroskopmultiplexing in Abhängigkeit von der Anzahl der verfügbaren Fluoreszenzfilter/Marker durchgeführt werden.

Protocol

Die Proben wurden prospektiv im Rahmen der CIRCAN-Kohorte (“CIRculating CANcer”) am Universitätskrankenhaus Lyon nach schriftlicher Zustimmung des Patienten gesammelt. Diese Studie wurde in die Kohorte CIRCAN_ALL integriert. Die Studie CIRCAN_ALL wurde von der CPP South-East IV vom 04.11.2015 unter der Referenz L15-188 als nicht interventional anerkannt. Eine geänderte Fassung wurde am 20.09.2016 unter der Nummer L16-160 als nicht interventionvoll anerkannt. Die CIRCAN_ALL-Studie wurde dem IT- und Freiheitskorresponden…

Representative Results

Die erste Voraussetzung war, unkontaminierte (infektiöse erregfreie) Sammlungen von CTCs für die Gewebekultur zu erhalten und IF-Hintergrund zu vermeiden. Das Dekontaminationsprotokoll ermöglichte die Reinigung aller Rohre und Pumpen und führte zur Sammlung von CTCs mit einer guten Rückgewinnungsrate ohne bakterielle Kontamination. Die angereicherten Proben wurden ohne und mit dem Dekontaminationsprotokoll-Workflow des spiralförmigen mikrofluidischen Geräts verglichen. Zur Validierung des Dekontaminationsprotokoll…

Discussion

In der vorliegenden Studie wurden zwei wichtige Punkte angesprochen, der erste in Bezug auf die Leistung des Workflows für seine Übertragung auf klinische Anwendungen und der zweite in Bezug auf die Abnahme der Subjektivität für die Analyse der erhaltenen Fluoreszenzbilder.

Ein performanter und optimierter Workflow für die CTC-Enumeration wurde zunächst mit anpassbarem IF-Assay nach Zellanreicherung über ein CTC-etikettenfreies mikrofluidisches System (spiralmikrofluidisches Gerät) erm…

Materials

4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Ozyme	BLE 422801	Storage conditions: +4°C
BD Facs Clean – 5L	BD Biosciences	340345	Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature
Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL	Biolidics	CBB-F016012	Bleach. Storage conditions: Room temperature
Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5%	Sigma	A8412	Storage conditions: +4°C
CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647	BioLegend	BLE304020	Storage conditions: +4°C
CellProfiler Software	Broad Institute		Image Analysis Software
Centrifuge device	Hettich	4706	Storage conditions: Room temperature
Centrifuge tube 50 mL	Corning	430-829	Storage conditions: Room temperature
Centrifuge Tube 15 mL	Biolidics	CBB-F001004-25	Storage conditions: Room temperature
ClearCell FX-1 System	Biolidics	CBB-F011002	Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature
Coulter Clenz Cleaning Agent – 5L	Beckman Coulter	8448222	All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature
CTChip FR1S	Biolidics	CBB-FR001002	Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature
Cytospin 4	ThermoFisher	A78300003	Storage conditions: Room temperature
Diluent Additive Reagent – 20 mL	Biolidics	CBB-F016009	Storage conditions: +4°C
EZ Cytofunnels	ThermoFisher	A78710003	Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature
FcR blocking Agent	Miltenyi Biotec	130-059-901	Storage conditions: +4°C
Fetal Calf Serum (FCS)	Gibco	10270-106	Storage conditions: +4°C
Fluoromount	Sigma	F4680	Mounting solution. Storage conditions: Room temperature
Fungizone – 50 mg	Bristol-Myers-Squibb	90129TB29	Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4°C
FX1 Input Straw with lock cap	Biolidics	CBB-F013005	Straw. Storage conditions: Room temperature
KovaSlide	Dutscher	50126	Chambered slide. Storage conditions: Room temperature
PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488	ThermoFisher	53-9003-80	Storage conditions: +4°C
Paraformaldehyde 16%	ThermoFisher	11490570	Fixation solution. Storage conditions: +4°C
PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) – Phycoerythrin	BioLegend	BLE329706	Storage conditions: +4°C
Petri Dish	Dutscher	632180	Storage conditions: Room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Ozyme	BE17-512F	Storage conditions: +4°C
Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1X – 1L	1st Base Laboratory	BUF-2040-1X1L	Storage conditions: Room temperature
Pluronic F-68 10%	Gibco	24040-032	Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature
Polylysine slides	ThermoFisher	J2800AMNZ	Storage conditions: Room temperature
Polypropylene Conical Tube 50 mL	Falcon	352098	Storage conditions: Room temperature
RBC Lysis Buffer – 100 mL	G Biosciences	786-649	Storage conditions: +4°C
RBC Lysis Buffer – 250 mL	G Biosciences	786-650	Storage conditions: +4°C
Resuspension Buffer (RSB)	Biolidics	CBB-F016003	Storage conditions: +4°C
Shandon Cytopsin4 centrifuge	ThermoFisher	A78300003	Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature
Silicon Isolator	Grace bio-Labs	664270	Storage conditions: Room temperature
Sterile Deionized Water – 100 mL	1st Base Laboratory	CUS-4100-100ml	Storage conditions: Room temperature
Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1	Zeiss		Storage conditions: Room temperature
Surgical Sterile Bag	SPS Laboratoires	98ULT01240	Storage conditions: Room temperature
Syringe BD Discardit II 20 mL sterile	BD Biosciences	300296	Storage conditions: Room temperature
Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile	ClearLine	51732	Storage conditions: Room temperature
Zen lite 2.3 Lite Software	Zeiss		Microscope associated software