Semi-אוטומטי PD-L1 אפיון וספירה של תאים סרטניים במחזור בין שאינם קטנים תאים סרטן ריאות חולים על ידי Immunofluorescence
Summary
האפיון של מחזורי תאים סרטניים (CTCs) הוא נושא פופולרי במחקר טרנסלtional. פרוטוקול זה מתאר את הטיפול באופן אוטומטי למחצה החיסונית (IF) לאפיון PD-L1 וספירה של CTCs בסרטן ריאות תאים שאינם קטנים (NSCLC) מטופלים דגימות.
Abstract
במחזור תאים סרטניים (CTCs) נגזר הגידול העיקרי הם לשפוך לתוך הדם או מערכת הלימפה. אלה תאים נדירים (1-10 תאים לכל mL של דם) צו פרוגנוזה גרועה מתואמים עם הישרדות הכוללת קצר יותר בסרטן מספר (g., השד, הערמונית המעי הגס). כיום, anti-EpCAM-מצופה מגנטי חרוז מבוסס CTC לכידת מערכת היא הבדיקה הסטנדרטית זהב שאושרו על ידי ארה ב. מינהל המזון והתרופות (FDA) לספירת CTCs במחזור הדם. בדיקה זו מבוססת על השימוש חרוזים מגנטיים מצופה עם אנטי EpCAM סמנים, אשר במיוחד יעד תאים סרטניים אפיתל. מחקרים רבים מומחשים כי EpCAM אינו סמן אופטימלי עבור זיהוי CTC. אכן, CTCs הם אוכלוסיית משנה הטרוגנית של תאים סרטניים והם מסוגלים לעבור מעבר אפיתל-to-mesenchal (חובש) הקשורים התפשטות גרורתית ופלישה. CTCs אלה מסוגלים להפחית את הביטוי של משטח התא האפיתל סמן EpCAM, תוך הגדלת סמנים mesenchymal כגון vimentin. כדי לטפל במשוכה טכנית, פותחו שיטות בידוד אחרות המבוססות על תכונות פיזיות של CTCs. טכנולוגיות מיקרופלואידיסי מאפשרות גישה נטולת תוויות להעשרה CTC מדגימות דם שלמות. הטכנולוגיה מיקרופלואידיג ספירלה משתמשת האינרציה וכוחות לגרור דין עם זרימה רציפה בערוצים מעוקלים שנוצר בתוך שבב מיקרופלואידיג ספירלה. התאים מופרדים על בסיס הבדלים בגודל ובפלסטיות בין תאי דם נורמליים ותאים מוסריים. פרוטוקול זה מפרט את השלבים השונים כדי לאפיין את ביטוי המוות מתוכנת (PD-L1) של CTCs, שילוב מכשיר מיקרופלואידיג ספירלה עם להתאמה אישית מערכת הסימון החיסונית (IF) מוגדר.
Introduction
אנטיגן הגידול-ספציפי ציטוטוקסיים T-לימפוציטים (CTLs) לשחק תפקיד מכריע בתגובה לסרטן באמצעות תהליך המכונה סרטן “מעקב החיסונית”. הפונקציות שלהם נגד הגידול משופרות על ידי נוגדנים הסגר מחסום חיסונית כגון CTLA-4 מעכבי ו-PD-1/PD-L1 מעכבי. בתוך סרטן ריאות תא קטן (NSCLC), anti-PD-1/PD-L1 תרפיות התוצאה שיעורי תגובה החל 0%-17% בחולים עם PD-L1-שלילי גידולים ו-36%-100% אלה ביטוי PD-L1. התגובות החזקות של PD-1/PD-L1 המצור נצפתה מלנומה ו-NSCLC מוצגים על ידי ראיות של שיפור שיעור התגובה הכולל (RR), הטבות קליניות עמידים, ו-הישרדות ללא התקדמות (PFS). כיום, הטיפולים anti-PD1 הם הסטנדרטים של טיפול בשורה השנייה NSCLC עם nivolumab ללא קשר לביטוי PD-L1 עם פמרופזואב בחולים ביטוי PD-L1 ≥ 1%. בטיפול בשורה הראשונה, התקן של טיפול הוא פפמוליזאז לבד בחולים עם nsclc ביטוי PD-L1 ≥ 50% והוא יכול להיות משופר עם כימותרפיה (פלטין ובספק התרופה בהתאם לסוג היסטולוגית)1,2.
עם זאת, גישה זו לניהול החולה הוא שויכוח3, מאז PD-L1 ביטוי בתאי הגידול על ידי אימונוהיסטוכימיה (ihc) הוא כנראה לא האידיאלי ביותר לוויה ביואריקר. אחרים כגון נטל מוטציה הגידול4 (tmb), אי יציבות MICROSATELLITE (MSI), ו/או microbiota הם אולי מעניינים בהגדרה זו בלבד או בשילוב. Nsclc ידועים להיות גידולים הטרוגנית, או מרחב (מאתר הגידול לאחד אחר) או באופן זמני (מאבחנה להישנות). חולים עם NSCLC הם בדרך כלל שבירים, ו איטרטיבי רקמות פולשני עשוי להיות בעיה. אכן, re-ביופסיה שיעור בטווחים התקדמות ראשונה מ 46%-84% בהתאם לסדרה, ומוצלחת re-ביופסיה (כלומר עם ניתוח מולקולרי היסטולוגית ומלאה) נע בין 33%-75%. משמעות הדבר היא כי 25%-67% מהחולים לא יכולים לקבל ניתוח מחדש מקיף ביופסיה במהלך ההתקדמות הראשונה5,6,7,8.
הופעתו של “ביופסיות נוזלי” יצרה כך התלהבות ניכרת בהגדרה זו מסוים, כפי שהיא מאפשרת הערכה מכרעת של שינויים מולקולריים במהלך התקדמות המחלה על ידי בחינת מחזורי DNA חינם (cfDNA) נגזר במחזור תאים סרטניים (CTCs). אלה תאים חיים שוחררו מן הגידול לתוך זרם הדם, שם הם להסתובב בחופשיות. למרות שלא נעשה שימוש באופן שגרתי, הניתוח של CTCs נראה מבטיח מאוד במקרה של אפיון מולקולרי, פנוטי, פרוגנוזה, ומשמעות חזוי בסרטן הריאות (דרך Dnaseq, Rnaseq, mirna וניתוח חלבון). אכן, CTCs סביר להניח הנמל מאפיינים של המחלה הפעילה ולא את הסמנים הראשוניים (זוהה על ביופסיות רקמה באבחון). יתר על כן, CTCs לעקוף את הבעיה של טרוגניות מרחבית של רקמת הגידול, אשר עשוי להיות נושא מכריע ביופסיה קטנה. כתוצאה מכך, הביטוי PD-L1 ב-CTCs עשוי לשפוך אור על אי-התאמות הנגזרות מהשימוש בו כסמן חזוי באמצעות רקמת הגידול.
לאחרונה, ביטוי PD-L1 נבדק ב-CTCs של NSCLC. כמעט כל המטופלים נבדקו9 היו PD-L1 חיוביים, מסבך את הפרשנות של התוצאה ואת השימוש הקליני שלה. הכולל, PD-L1-CTCs החיוביים זוהו ב 69.4% של דגימות מ ממוצע של 4.5 תאים/mL10. לאחר החניכה של טיפול בקרינה, היחס של CTCs PD-L1-חיוביים העלה באופן משמעותי, המציין upregulation של ביטוי PD-L1 בתגובה קרינה11. מכאן, הניתוח PD-L1 CTCs עשוי לשמש כדי לנטר שינויים דינמיים של הגידול ואת התגובה החיסונית, אשר עשוי לשקף את התגובה לכימותרפיה, קרינה, וסביר טיפול חיסוני (IT) טיפולים.
עד היום, בידוד ctcs ואפיון PD-L1 מסתמכים על שיטות שונות כגון אנטי-epcam-מצופה מגנטי מבוסס חרוזים CTC לכידת, העשרה המבוססת על מבוסס בחינם, וגודל מבוסס12,13 CTC לכידת assays. עם זאת, CTCs זוהו רק 45%-65% מהחולים עם NSCLC גרורתית, ובכך להגביל את יכולתם לספק כל מידע עבור יותר ממחצית מהחולים NSCLC גרורתית. בנוסף, CTC ספירה היה נמוך ברוב המחקרים הללו באמצעות גודל מבוסס גישה10. יתר על כן, שיטה זו הובילה לסתירות כגון זיהוי של CD45 (-)/DAPI (+) תאים עם “הדפוסים הציפולוגיים של ממאירות” במחזור הדם של תורמים בריאים. חששות אלה להדגיש את הצורך בשיטה רגישה מאוד של אוסף CTC הקשורים החיסונית-פנוטיפים של טיפוסי CD45 (-) תאים מדם שלם בריא באמצעות סמנים סרטניים נוספים (כלומר, TTF1, Vimentin, EpCAM, ו CD44) ב NSCLC.
כתוצאה מכך, הערכנו מכשיר מיקרופלואידיג ספירלי שמשתמש באינרציה והדיקן גורר כוחות כדי להפריד בין תאים בהתאם לגודל ולפלסטיות באמצעות שבב מיקרופלואידיסי. היווצרות של מערבולת דין זורם בנוכחות שבב microfluidic התוצאות CTCs גדול יותר הממוקם לאורך הקיר הפנימי ותאים חיסוניים קטנים יותר לאורך הקיר החיצוני של השבב. תהליך ההעשרה מושלם על ידי שאיפה התאים הגדולים ביותר לשקע הגבייה כשבר CTC מועשר. שיטה זו רגישה במיוחד וספציפית (זיהוי של סביב 1 CTC/mL של דם שלם)14 והוא יכול להיות משויך עם ניתוח החיסונית המותאם אישית (IF). כלים אלה יאפשרו הגדרה של סף חיובי לפרשנות הקלינית. באופן זה מתואר זרימת עבודה המאפשרת לביולוגים לבודד ולהחיסלול CTCs בקצב גבוה של שחזור וספציפיות. הפרוטוקול מתאר שימוש אופטימלי במכשיר המיקרופלואידיג ספירלה כדי לאסוף CTCs, האופטימיזציה IF ממוטבת שניתן להתאים אישית על פי סוג סרטן, ושימוש חינם בקוד פתוח תוכנה למדידת וניתוח תמונות תא לבצע חצי אוטומטי מונה התאים בהתאם לצביעת פלורסנט. בנוסף, ריבוב מיקרוסקופ יכול להתבצע בהתאם למספר מסנני פלורסנט/סמנים זמינים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שתי נקודות עיקריות גדלו במחקר הנוכחי, הראשון ביחס לביצועים של זרימת העבודה על העברתו ליישומים קליניים, והשני בנוגע לירידה בסובייקטיביות לניתוח של תמונות פלואורסצנטית שהתקבלו.
זרימת עבודה ממוטבת ומיטבית עבור ספירת CTC נקבעה בתחילה באמצעות שיטת IF הניתנת להתאמה אישית לאחר הע?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר של אסטרצמקה (לונדון, הממלכה המאוחדת), ביולידיה (סינגפור) והסרטן ליגה לה (Saone et הלואר, צרפת). המחברים מודים לחברות אסטרסנקה וביולידיה על תמיכתם הכספית.
Materials
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Ozyme | BLE 422801 | Storage conditions: +4°C |
| BD Facs Clean – 5L | BD Biosciences | 340345 | Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature |
| Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL | Biolidics | CBB-F016012 | Bleach. Storage conditions: Room temperature |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% | Sigma | A8412 | Storage conditions: +4°C |
| CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 | BioLegend | BLE304020 | Storage conditions: +4°C |
| CellProfiler Software | Broad Institute | Image Analysis Software | |
| Centrifuge device | Hettich | 4706 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge tube 50 mL | Corning | 430-829 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge Tube 15 mL | Biolidics | CBB-F001004-25 | Storage conditions: Room temperature |
| ClearCell FX-1 System | Biolidics | CBB-F011002 | Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature |
| Coulter Clenz Cleaning Agent – 5L | Beckman Coulter | 8448222 | All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature |
| CTChip FR1S | Biolidics | CBB-FR001002 | Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature |
| Cytospin 4 | ThermoFisher | A78300003 | Storage conditions: Room temperature |
| Diluent Additive Reagent – 20 mL | Biolidics | CBB-F016009 | Storage conditions: +4°C |
| EZ Cytofunnels | ThermoFisher | A78710003 | Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature |
| FcR blocking Agent | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | Storage conditions: +4°C |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | Storage conditions: +4°C |
| Fluoromount | Sigma | F4680 | Mounting solution. Storage conditions: Room temperature |
| Fungizone – 50 mg | Bristol-Myers-Squibb | 90129TB29 | Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4°C |
| FX1 Input Straw with lock cap | Biolidics | CBB-F013005 | Straw. Storage conditions: Room temperature |
| KovaSlide | Dutscher | 50126 | Chambered slide. Storage conditions: Room temperature |
| PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | 53-9003-80 | Storage conditions: +4°C |
| Paraformaldehyde 16% | ThermoFisher | 11490570 | Fixation solution. Storage conditions: +4°C |
| PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) – Phycoerythrin | BioLegend | BLE329706 | Storage conditions: +4°C |
| Petri Dish | Dutscher | 632180 | Storage conditions: Room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Ozyme | BE17-512F | Storage conditions: +4°C |
| Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1X – 1L | 1st Base Laboratory | BUF-2040-1X1L | Storage conditions: Room temperature |
| Pluronic F-68 10% | Gibco | 24040-032 | Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature |
| Polylysine slides | ThermoFisher | J2800AMNZ | Storage conditions: Room temperature |
| Polypropylene Conical Tube 50 mL | Falcon | 352098 | Storage conditions: Room temperature |
| RBC Lysis Buffer – 100 mL | G Biosciences | 786-649 | Storage conditions: +4°C |
| RBC Lysis Buffer – 250 mL | G Biosciences | 786-650 | Storage conditions: +4°C |
| Resuspension Buffer (RSB) | Biolidics | CBB-F016003 | Storage conditions: +4°C |
| Shandon Cytopsin4 centrifuge | ThermoFisher | A78300003 | Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature |
| Silicon Isolator | Grace bio-Labs | 664270 | Storage conditions: Room temperature |
| Sterile Deionized Water – 100 mL | 1st Base Laboratory | CUS-4100-100ml | Storage conditions: Room temperature |
| Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 | Zeiss | Storage conditions: Room temperature | |
| Surgical Sterile Bag | SPS Laboratoires | 98ULT01240 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe BD Discardit II 20 mL sterile | BD Biosciences | 300296 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile | ClearLine | 51732 | Storage conditions: Room temperature |
| Zen lite 2.3 Lite Software | Zeiss | Microscope associated software |
References
- Gandhi, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).
- Paz-Ares, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).
- Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
- Hellmann, M. D., et al. Tumor Mutational Burden and Efficacy of Nivolumab Monotherapy and in Combination with Ipilimumab in Small-Cell Lung Cancer. Cancer Cell. 33 (5), 853-861 (2018).
- Chouaid, C., et al. Feasibility and clinical impact of re-biopsy in advanced non small-cell lung cancer: a prospective multicenter study in a real-world setting (GFPC study 12-01). Lung cancer. 86 (2), 170-173 (2014).
- Nosaki, K., et al. Re-biopsy status among non-small cell lung cancer patients in Japan: A retrospective study. Lung cancer. 101, 1-8 (2016).
- Uozu, S., et al. Feasibility of tissue re-biopsy in non-small cell lung cancers resistant to previous epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor therapies. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 175 (2017).
- Kim, T. O., et al. Feasibility of re-biopsy and EGFR mutation analysis in patients with non-small cell lung cancer. Thoracic Cancer. 9 (7), 856-864 (2018).
- Nicolazzo, C., et al. Monitoring PD-L1 positive circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patients treated with the PD-1 inhibitor Nivolumab. Scientific Reports. 6, 31726 (2016).
- Guibert, N., et al. PD-L1 expression in circulating tumor cells of advanced non-small cell lung cancer patients treated with nivolumab. Lung cancer. 120, 108-112 (2018).
- Wang, Y., et al. PD-L1 Expression in Circulating Tumor Cells Increases during Radio(chemo)therapy and Indicates Poor Prognosis in Non-small Cell Lung Cancer. Scientific Reports. 9 (1), 566 (2019).
- Hao, S. -. J., Wan, Y., Xia, Y. -. Q., Zou, X., Zheng, S. -. Y. Size-based separation methods of circulating tumor cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 125, 3-20 (2018).
- Williams, A., Balic, M., Datar, R., Cote, R. Size-based enrichment technologies for CTC detection and characterization. Recent results in cancer research. Fortschritte der Krebsforschung. Progres dans les recherches sur le cancer. 195, 87-95 (2012).
- Garcia, J., et al. Profiling of Circulating Tumor DNA (ctDNA) in Plasma of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, Monitoring of EGFR p.T790M mutated allelic fraction using BEAMing Companion Assay and Evaluation in future application in mimicking Circulating Tumors Cells (mCTC). Cancer Medicine. , (2019).
- Garcia, J., et al. Evaluation of pre-analytical conditions and comparison of the performance of several digital PCR assays for the detection of major EGFR mutations in circulating DNA from non-small cell lung cancers: the CIRCAN_0 study. Oncotarget. 8 (50), 87980-87996 (2017).
- Lustberg, M. B., et al. Heterogeneous atypical cell populations are present in blood of metastatic breast cancer patients. Breast Cancer Research. 16 (2), 23 (2014).
- Ilie, M., et al. “Sentinel” circulating tumor cells allow early diagnosis of lung cancer in patients with chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 9 (10), 111597 (2014).
- Khoo, B. L., et al. Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells. PLoS ONE. 9 (7), 99409 (2014).
- Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
- Biswas, A., et al. Clinical performance of endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for assessing programmed death ligand-1 expression in nonsmall cell lung cancer. Diagnostic Cytopathology. 46 (5), 378-383 (2018).
- Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).
