면역형광에 의한 비소세포 폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 열거
Summary
순환 종양 세포의 특성 (CTC)는 번역 연구에서 인기있는 주제입니다. 이 프로토콜은 비소세포 폐암(NSCLC) 환자 샘플에서 CTC의 PD-L1 특성화 및 열거에 대한 반자동 면역형광(IF) 분석방법을 기술한다.
Abstract
순환 종양 세포 (CTC) 원발성 종양에서 파생 된 혈 류 또는 림프 계로 창 고. 이 희소한 세포 (혈액의 mL 당 1-10 세포)는 나쁜 예후를 보증하고 몇몇 암에 있는 더 짧은 전반적인 생존과 상관됩니다 (예를 들면, 유방, 전립선 및 colorectal). 현재, 반대로 EpCAM 코팅된 자기 비드 기지를 둔 CTC 포획 시스템은 혈류량에 있는 CTC를 열거하기 위한 미국 식품의약국 (FDA)에 의해 승인된 금 표준 시험입니다. 이 시험은 상피 암 세포를 특히 표적으로 하는 반대로 EpCAM 마커로 코팅된 자기 구슬의 사용에 근거를 두어. 많은 연구는 EpCAM이 CTC 검출을 위한 최적 마커가 아니라는 것을 설명했습니다. 실제로, CTC는 암세포의 이질적인 하위 집단이고 전이성 증식 및 침략과 관련되었던 상피-중간엽 전이 (EMT)를 겪을 수 있습니다. 이들 CTC는 비멘틴과 같은 중간엽 마커를 증가시키면서 세포 표면 상피 마커 EpCAM의 발현을 감소시킬 수 있다. 이러한 기술적 장애물을 해결하기 위해 CTC의 물리적 특성에 기반한 다른 격리 방법이 개발되었습니다. 미세 유체 기술은 전혈 샘플에서 CTC 농축에 대한 라벨없는 접근 방식을 가능하게합니다. 나선형 미세 유체 기술은 나선형 미세 유체 칩 내에서 생성된 곡선 채널에서 연속적인 흐름을 가진 관성 및 딘 드래그 힘을 사용합니다. 세포는 일반적인 혈액 세포와 종양 세포 사이 크기 그리고 가소성의 차이에 근거하여 분리됩니다. 이 프로토콜은 CC의 프로그래밍된 데스-리간드 1(PD-L1) 발현을 특성화하기 위한 상이한 단계를 상세히 설명하며, 나선형 미세유체 디바이스와 맞춤형 면역형광(IF) 마커 세트를 결합한다.
Introduction
종양 항원 특이적 세포독성 T-림프구(CTL)는 암 “면역 감시”로 알려진 과정을 통해 암에 대한 반응에 중요한 역할을 한다. 그들의 항 종양 기능은 CTLA-4 억제제 및 PD-1/PD-L1 억제제와 같은 면역 체크포인트 봉쇄 항체에 의해 강화됩니다. 비 소세포 폐암에서 (NSCLC), 반대로 PD-1/PD-L1 치료는 PD-L1 음성 종양을 가진 환자에 있는 0%-17%에서 구역 수색하는 반응 비율 귀착되고 PD-L1를 발현하는 사람들에 있는 36%-100%. 흑색종과 NSCLC에서 관찰된 PD-1/PD-L1 봉쇄에 대한 강력한 반응은 전반적인 반응 속도(RR), 내구성 임상 적 이점 및 무진행 생존(PFS)의 증거로 나타났습니다. 현재, 반대로 PD1 처리는 PD-L1 발현에 관계없이 nivolumab를 가진 2 차 선 NSCLC 처리에 있는 배려의 표준 및 PD-L1 ≥1%를 발현하는 환자에 있는 펨브롤리주맙을 가진. 1 차 줄 치료에서, 치료의 표준은 PD-L1 ≥50%를 발현하는 NSCLC 환자에서 단독으로 펨브롤리주맙이며 화학요법 (독성 및 이글약물)으로 잠재적으로 강화될 수 있다1,2.
그러나, 이러한 환자 관리에 대한 접근법은 논란의 여지가3,면역히스토화학(IHC)에 의한 종양 세포에서의 PD-L1 발현이 아마도 가장 이상적인 동반자 바이오마커가 아닐 수 있기 때문에. 종양 돌연변이 부담4 (TMB), 마이크로 위성 불안정성 (MSI) 및 / 또는 microbiota와 같은 다른 사람들은 단독으로 또는 조합이 설정에서 아마도 흥미롭습니다. NSCLC는 이질적인 종양, 공간적으로 (종양 사이트에서 다른 종양 사이트로) 또는 일시적으로 (진단에서 재발까지)로 알려져 있습니다. NSCLC를 가진 환자는 일반적으로 깨지기 쉽고, 반복적인 침략적인 조직 생검이 문제가 될 수 있습니다. 실제로, 첫번째 진행에 있는 재생검 비율은 시리즈에 따라서 46%-84%에서 범위이고, 성공적인 재생검 (조직학 및 가득 차있는 분자 분석으로 의미) 범위는 33%-75%. 이것은 환자의 25%-67%가 첫번째 진행도중포괄적인 재생검 분석을 수신할 수 없다는 것을 의미합니다 5,6,7,8.
“액체 생검”의 출현은 순환에서 파생된 순환 하는 자유로운 DNA (cfDNA)를 검토하 여 질병 진행 도중 분자 변경의 결정적인 재평가를 가능하게 하기 때문에 이렇게 이 특정 한 조정에 있는 상당한 열정을 생성했습니다 종양 세포 (CTC). 이 살아있는 세포는 혈류량으로 종양에서 풀어 놓입니다, 여기서 자유롭게 순환합니다. 일상적으로 사용되지는 않지만 CTC의 분석은 폐암에서 분자 및 표현형 특성, 예후 및 예측 유의성 (DNAseq, RNA, miRNA 및 단백질 분석을 통해)의 경우 매우 유망한 것으로 보입니다. 실제로, CTC는 초기 마커보다는 활성 질환의 현상형 특성을 항구할 가능성이 있습니다 (진단시 조직 생검에서 검출). 게다가, CTC는 작은 생검에 있는 결정적인 문제점일지도 모르다 종양 조직의 공간 이질성의 문제를 우회합니다. 따라서, CTC에 대한 PD-L1 발현은 종양 조직을 이용한 예측 바이오마커로서의 사용으로부터 유래된 불일치에 잠재적으로 빛을 비출 수 있다.
최근, PD-L1 발현은 NSCLC의 CTC에서 시험되었다. 9를 시험한 거의 모든 환자는 PD-L1 양성이었고, 결과와 임상 사용의 해석을 복잡하게 했다. 전반적으로, PD-L1 양성 CTC는 평균 4.5 세포/mL10에서샘플의 69.4%에서 검출되었습니다. 방사선 요법의 개시 후, PD-L1 양성 CTC의 비율이 크게 증가하여, 방사선11에대한 반응으로 PD-L1 발현의 상향 조절을 나타낸다. 그러므로, PD-L1 CTC 분석은 화학요법, 방사선 및 가능성 면역 요법 (IT) 처리에 반응을 반영할 수 있는 종양 및 면역 반응의 동적 변경을 감시하기 위하여 이용될 수 있습니다.
현재까지 CTC 격리 및 PD-L1 특성화는 안티 EpCAM 코팅 자기 비드 기반 CTC 캡처, 농축 없는 기반 분석 및 크기 기반12,13 CTC 캡처 분석과 같은 다양한 방법에 의존합니다. 그러나, CTC는 전이성 NSCLC를 가진 환자의 45%-65%에서만 검출되었습니다, 따라서 전이성 NSCLC 환자의 반 이상을 위한 어떤 정보든지 를 제공하는 그들의 기능을 제한하. 또한, CTC 수는 크기 기반 접근법10을사용하여 이러한 연구의 대부분에서 낮았다. 더욱이, 이 방법은 건강한 기증자의 혈류량에 있는 “악성의 세포형태 패턴”을 가진 CD45(-)/DAPI(+) 세포의 검출과 같은 불일치로 이끌어 냈습니다. 이러한 관심사는 NSCLC에서 추가적인 암 바이오마커(즉, TTF1, Vimentin, EpCAM 및 CD44)를 사용하여 건강한 전혈에서 비정형 CD45(-) 세포의 면역 형피와 관련된 CTC 수집의 매우 민감한 방법에 대한 필요성을 강조합니다.
그 결과, 우리는 미세 유체 칩을 통해 크기와 가소성에 따라 세포를 분리하기 위해 관성 및 딘 드래그 힘을 사용하는 나선형 미세 유체 장치를 평가했습니다. 미세 유체 칩에 존재하는 딘 소용돌이 흐름의 형성은 칩의 외벽을 따라 내벽과 더 작은 면역 세포를 따라 위치한 더 큰 CTC를 초래합니다. 농축 과정은 농축 된 CTC 분획으로 수집 출구로 더 큰 세포를 사이펀하여 완료됩니다. 이 방법은 특히 민감하고 특이적(전혈의 약 1 CTC/mL의 검출)14이며 맞춤형 면역형광(IF) 분석과 연관될 수 있다. 이러한 도구는 임상 해석을위한 긍정적 인 임계 값을 설정할 수 있습니다. 따라서 생물학자가 높은 회복률과 특이성을 가진 CTC를 분리하고 면역 표현형 CTC를 분리할 수 있도록 하는 워크플로우가 설명됩니다. 이 프로토콜은 CC를 수집하는 나선형 미세 유체 장치의 최적 사용, 암 유형에 따라 사용자 정의 할 수있는 최적화 된 IF 분석, 세포 이미지를 측정하고 분석하기위한 무료 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 반자동 을 수행하는 방법을 설명합니다. 형광 염색에 따라 세포의 수치. 또한, 현미경 멀티플렉싱은 사용 가능한 형광 필터/마커의 수에 따라 수행될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구에서 두 가지 주요 포인트가 제기되었으며, 첫 번째는 임상 응용으로의 이송을 위한 워크플로우의 성능에 관한 것이고, 두 번째는 얻어진 형광 이미지의 분석을 위한 주관성의 감소에 관한 것이다.
CTC 열거를 위한 수행및 최적화된 워크플로우는 CTC 라벨없는 미세 유체 시스템(나선형 미세 유체 장치)을 통해 세포 농축 후 사용자 정의 IF 분석을 사용하여 처음에 결정되?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 아스트라제네카(런던, 영국), 바이오리딕스(싱가포르), 리그 콘트르 르 암(사오네 에 루아르, 프랑스)의 연구 보조금에 의해 지원되었습니다. 저자는 그들의 재정 지원을 위해 아스트라 제네카와 바이오 리딕스 회사에 감사드립니다.
Materials
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Ozyme | BLE 422801 | Storage conditions: +4°C |
| BD Facs Clean – 5L | BD Biosciences | 340345 | Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature |
| Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL | Biolidics | CBB-F016012 | Bleach. Storage conditions: Room temperature |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% | Sigma | A8412 | Storage conditions: +4°C |
| CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 | BioLegend | BLE304020 | Storage conditions: +4°C |
| CellProfiler Software | Broad Institute | Image Analysis Software | |
| Centrifuge device | Hettich | 4706 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge tube 50 mL | Corning | 430-829 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge Tube 15 mL | Biolidics | CBB-F001004-25 | Storage conditions: Room temperature |
| ClearCell FX-1 System | Biolidics | CBB-F011002 | Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature |
| Coulter Clenz Cleaning Agent – 5L | Beckman Coulter | 8448222 | All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature |
| CTChip FR1S | Biolidics | CBB-FR001002 | Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature |
| Cytospin 4 | ThermoFisher | A78300003 | Storage conditions: Room temperature |
| Diluent Additive Reagent – 20 mL | Biolidics | CBB-F016009 | Storage conditions: +4°C |
| EZ Cytofunnels | ThermoFisher | A78710003 | Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature |
| FcR blocking Agent | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | Storage conditions: +4°C |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | Storage conditions: +4°C |
| Fluoromount | Sigma | F4680 | Mounting solution. Storage conditions: Room temperature |
| Fungizone – 50 mg | Bristol-Myers-Squibb | 90129TB29 | Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4°C |
| FX1 Input Straw with lock cap | Biolidics | CBB-F013005 | Straw. Storage conditions: Room temperature |
| KovaSlide | Dutscher | 50126 | Chambered slide. Storage conditions: Room temperature |
| PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | 53-9003-80 | Storage conditions: +4°C |
| Paraformaldehyde 16% | ThermoFisher | 11490570 | Fixation solution. Storage conditions: +4°C |
| PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) – Phycoerythrin | BioLegend | BLE329706 | Storage conditions: +4°C |
| Petri Dish | Dutscher | 632180 | Storage conditions: Room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Ozyme | BE17-512F | Storage conditions: +4°C |
| Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1X – 1L | 1st Base Laboratory | BUF-2040-1X1L | Storage conditions: Room temperature |
| Pluronic F-68 10% | Gibco | 24040-032 | Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature |
| Polylysine slides | ThermoFisher | J2800AMNZ | Storage conditions: Room temperature |
| Polypropylene Conical Tube 50 mL | Falcon | 352098 | Storage conditions: Room temperature |
| RBC Lysis Buffer – 100 mL | G Biosciences | 786-649 | Storage conditions: +4°C |
| RBC Lysis Buffer – 250 mL | G Biosciences | 786-650 | Storage conditions: +4°C |
| Resuspension Buffer (RSB) | Biolidics | CBB-F016003 | Storage conditions: +4°C |
| Shandon Cytopsin4 centrifuge | ThermoFisher | A78300003 | Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature |
| Silicon Isolator | Grace bio-Labs | 664270 | Storage conditions: Room temperature |
| Sterile Deionized Water – 100 mL | 1st Base Laboratory | CUS-4100-100ml | Storage conditions: Room temperature |
| Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 | Zeiss | Storage conditions: Room temperature | |
| Surgical Sterile Bag | SPS Laboratoires | 98ULT01240 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe BD Discardit II 20 mL sterile | BD Biosciences | 300296 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile | ClearLine | 51732 | Storage conditions: Room temperature |
| Zen lite 2.3 Lite Software | Zeiss | Microscope associated software |
References
- Gandhi, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).
- Paz-Ares, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).
- Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
- Hellmann, M. D., et al. Tumor Mutational Burden and Efficacy of Nivolumab Monotherapy and in Combination with Ipilimumab in Small-Cell Lung Cancer. Cancer Cell. 33 (5), 853-861 (2018).
- Chouaid, C., et al. Feasibility and clinical impact of re-biopsy in advanced non small-cell lung cancer: a prospective multicenter study in a real-world setting (GFPC study 12-01). Lung cancer. 86 (2), 170-173 (2014).
- Nosaki, K., et al. Re-biopsy status among non-small cell lung cancer patients in Japan: A retrospective study. Lung cancer. 101, 1-8 (2016).
- Uozu, S., et al. Feasibility of tissue re-biopsy in non-small cell lung cancers resistant to previous epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor therapies. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 175 (2017).
- Kim, T. O., et al. Feasibility of re-biopsy and EGFR mutation analysis in patients with non-small cell lung cancer. Thoracic Cancer. 9 (7), 856-864 (2018).
- Nicolazzo, C., et al. Monitoring PD-L1 positive circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patients treated with the PD-1 inhibitor Nivolumab. Scientific Reports. 6, 31726 (2016).
- Guibert, N., et al. PD-L1 expression in circulating tumor cells of advanced non-small cell lung cancer patients treated with nivolumab. Lung cancer. 120, 108-112 (2018).
- Wang, Y., et al. PD-L1 Expression in Circulating Tumor Cells Increases during Radio(chemo)therapy and Indicates Poor Prognosis in Non-small Cell Lung Cancer. Scientific Reports. 9 (1), 566 (2019).
- Hao, S. -. J., Wan, Y., Xia, Y. -. Q., Zou, X., Zheng, S. -. Y. Size-based separation methods of circulating tumor cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 125, 3-20 (2018).
- Williams, A., Balic, M., Datar, R., Cote, R. Size-based enrichment technologies for CTC detection and characterization. Recent results in cancer research. Fortschritte der Krebsforschung. Progres dans les recherches sur le cancer. 195, 87-95 (2012).
- Garcia, J., et al. Profiling of Circulating Tumor DNA (ctDNA) in Plasma of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, Monitoring of EGFR p.T790M mutated allelic fraction using BEAMing Companion Assay and Evaluation in future application in mimicking Circulating Tumors Cells (mCTC). Cancer Medicine. , (2019).
- Garcia, J., et al. Evaluation of pre-analytical conditions and comparison of the performance of several digital PCR assays for the detection of major EGFR mutations in circulating DNA from non-small cell lung cancers: the CIRCAN_0 study. Oncotarget. 8 (50), 87980-87996 (2017).
- Lustberg, M. B., et al. Heterogeneous atypical cell populations are present in blood of metastatic breast cancer patients. Breast Cancer Research. 16 (2), 23 (2014).
- Ilie, M., et al. “Sentinel” circulating tumor cells allow early diagnosis of lung cancer in patients with chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 9 (10), 111597 (2014).
- Khoo, B. L., et al. Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells. PLoS ONE. 9 (7), 99409 (2014).
- Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
- Biswas, A., et al. Clinical performance of endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for assessing programmed death ligand-1 expression in nonsmall cell lung cancer. Diagnostic Cytopathology. 46 (5), 378-383 (2018).
- Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).
