Caracterización semiautomática PD-L1 y enumeración de células tumorales circulantes de pacientes con cáncer de pulmón celular no pequeño por inmunofluorescencia

Summary

La caracterización de las células tumorales circulantes (CTC) es un tema popular en la investigación traslacional. Este protocolo describe un ensayo de inmunofluorescencia semiautomática (IF) para la caracterización y enumeración de CTCs en muestras de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

Abstract

Las células tumorales circulantes (CTC) derivadas del tumor primario se derraman en el torrente sanguíneo o en el sistema linfático. Estas células raras (1 a 10 células por ml de sangre) justifican un mal pronóstico y están correlacionadas con una supervivencia global más corta en varios tipos de cáncer (por ejemplo, mama, próstata y colorrectal). Actualmente, el sistema de captura de CTC basado en perlas magnéticas recubierta con recubrimiento anti-EpCAM es la prueba estándar de oro aprobada por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por sus otros) para enumerar los CTC en el torrente sanguíneo. Esta prueba se basa en el uso de perlas magnéticas recubiertas con marcadores anti-EpCAM, que se dirigen específicamente a las células cancerosas epiteliales. Muchos estudios han ilustrado que EpCAM no es el marcador óptimo para la detección de CTC. De hecho, los CTC son una subpoblación heterogénea de células cancerosas y son capaces de someterse a una transición epitelial a mesenquimal (EMT) asociada con la proliferación e invasión metastásica. Estos CTC son capaces de reducir la expresión del marcador eptelítico de superficie celular EpCAM, mientras que aumentan los marcadores mesenquimales como la vimentina. Para hacer frente a este obstáculo técnico, se han desarrollado otros métodos de aislamiento basados en las propiedades físicas de los CTC. Las tecnologías microfluídicas permiten un enfoque sin etiquetas para el enriquecimiento de CTC a partir de muestras de sangre enteras. La tecnología microfluídica espiral utiliza las fuerzas de arrastre inercial y Dean con flujo continuo en canales curvos generados dentro de un chip microfluídico espiral. Las células se separan en función de las diferencias de tamaño y plasticidad entre las células sanguíneas normales y las células tumorales. Este protocolo detalla los diferentes pasos para caracterizar la expresión programada de la muerte-ligand 1 (PD-L1) de los CTC, combinando un dispositivo microfluídico espiral con un conjunto de marcadores de inmunofluorescencia personalizable (IF).

Introduction

Los linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos del antígeno tumoral desempeñan un papel crucial en la respuesta a los cánceres a través de un proceso conocido como “vigilancia inmune” del cáncer. Sus funciones antitumorales se ven reforzadas por anticuerpos de bloqueo de punto de control inmune como inhibidores de CTLA-4 e inhibidores de PD-1/PD-L1. En el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), las terapias anti-PD-1/PD-L1 dan como resultado tasas de respuesta que oscilan entre el 0% y el 17% en pacientes con tumores PD-L1 negativos y un 36%-100% en aquellos que expresan PD-L1. Las respuestas sólidas al bloqueo PD-1/PD-L1 observado según el melanoma y el NSCLC se muestran mediante evidencia de una mejor tasa de respuesta global (RR), beneficios clínicos duraderos y supervivencia libre de progresión (SLP). Actualmente, los tratamientos anti-PD1 son el estándar de atención en el tratamiento de Segunda Línea de NSCLC con nivolumab independientemente de la expresión de PD-L1 y con pembrolizumab en pacientes que expresan PD-L1 a 1%. En el tratamiento de primera línea, el estándar de atención es pembrolizumab solo en pacientes con CPSN que expresa PD-L1 el 50% y puede mejorarse potencialmente con quimioterapia (platin y doblete dependiendo del subtipo histológico)^1,2.

Sin embargo, este enfoque para el manejo del paciente es discutible³, ya que la expresión de PD-L1 en células tumorales por inmunohistoquímica (IHC) probablemente no es el biomarcador complementario más ideal. Otros como la carga de mutación tumoral⁴ (TMB), la inestabilidad de microsatélites (MSI) y/o la microbiota son posiblemente interesantes en este entorno, ya sea solo o en combinación. Se sabe que el CPNC son tumores heterogéneos, ya sea espacialmente (de un sitio tumoral a otro) o temporalmente (desde el diagnóstico hasta la recurrencia). Los pacientes con NSCLC suelen ser frágiles, y las biopsias de tejidos invasivos iterativos pueden ser un problema. De hecho, la tasa de rebiopsia en la primera progresión oscila entre 46%-84% dependiendo de la serie, y la re-biopsia exitosa (es decir, con análisis histológico y molecular completo) oscila entre 33%-75%. Esto significa que entre el 25% y el 67% delos pacientes no pueden recibir un análisis completo de la rebiopsia durante la primera progresión 5,^6,7,8.

Así pues, el advenimiento de las “biopsias líquidas” ha generado un entusiasmo considerable en este entorno particular, ya que permite una reevaluación crucial de las alteraciones moleculares durante la progresión de la enfermedad examinando el ADN libre circulante (ADNr) derivado de la circulación células tumorales (CTC). Estas células vivas se liberan del tumor hacia el torrente sanguíneo, donde circulan libremente. Aunque no se utiliza habitualmente, el análisis de los CTC parece ser muy prometedor en el caso de caracterización molecular y fenotípica, pronóstico y significación predictiva en el cáncer de pulmón (através de DNAseq, RNAseq, miRNA y análisis de proteínas). De hecho, es probable que los CTC albergan características fenotípicas de la enfermedad activa en lugar de los marcadores iniciales (detectados en biopsias de tejidos al momento del diagnóstico). Además, los CTC evitan el problema de la heterogeneidad espacial del tejido tumoral, que puede ser un problema crucial en pequeñas biopsias. En consecuencia, la expresión de PD-L1 en los CTC puede potencialmente arrojar luz sobre las discrepancias derivadas de su uso como biomarcador predictivo utilizando tejido tumoral.

Recientemente, la expresión PD-L1 se ha probado en CTC de NSCLC. Casi todos los pacientes evaluados⁹ fueron positivos en PD-L1, lo que complica la interpretación del resultado y su uso clínico. En general, se detectaron CTC con PD-L1 positivos en el 69,4% de las muestras a partir de un promedio de 4,5 células/ml^10. Después del inicio de la radioterapia, la proporción de CTC pd-L1 positivos aumentó significativamente, lo que indica una regulación ascendente de la expresión de PD-L1 en respuesta a la radiación^11. Por lo tanto, el análisis de CTC PD-L1 se puede utilizar para monitorear los cambios dinámicos del tumor y la respuesta inmunitaria, que pueden reflejar la respuesta a los tratamientos de quimioterapia, radiación y probable inmunoterapia (IT).

Hasta la fecha, el aislamiento de los CTC y la caracterización PD-L1 se basan en diversos métodos tales como la captura de CTC basada en perlas magnéticas recubierta santi-EpCAM, el ensayo basado en el enriquecimiento y los ensayos de captura¹²basados en el tamaño,¹³ CTC. Sin embargo, los CTC solo se detectaron en el 45%-65% de los pacientes con CPNC metastásico, lo que limita batuta su capacidad de proporcionar cualquier información para más de la mitad de los pacientes con CPNC metastásica. Además, el recuento de CTC fue bajo en la mayoría de estos estudios utilizando el enfoque basado en el tamaño¹⁰. Además, este método ha dado lugar a discrepancias como la detección de células CD45(-)/DAPI(+) con “patrones citomorfológicos de neoplasia maligna” en el torrente sanguíneo de donantes sanos. Estas preocupaciones ponen de relieve la necesidad de un método altamente sensible de recolección de CTC asociado con el fenotipado inmune de células atípicas CD45(-) de sangre entera sana utilizando biomarcadores adicionales de cáncer (es decir, TTF1, Vimentin, EpCAM y CD44) en NSCLC.

En consecuencia, evaluamos un dispositivo microfluídico en espiral que utiliza fuerzas de arrastre inercial y dedean para separar las células en función del tamaño y la plasticidad a través de un chip microfluídico. La formación de flujos de vórtice Dean presentes en el chip microfluídico da como resultado CTCs más grandes ubicados a lo largo de la pared interna y células inmunitarias más pequeñas a lo largo de la pared externa del chip. El proceso de enriquecimiento se completa siphoning las células más grandes en la salida de la colección como la fracción CTC enriquecida. Este método es particularmente sensible y específico (detección de alrededor de 1 CTC/ml de sangre entera)¹⁴ y puede asociarse con análisis personalizados de inmunofluorescencia (IF). Estas herramientas permitirán establecer un umbral positivo para la interpretación clínica. Se describe así un flujo de trabajo que permite a los biólogos aislar e inmunofenotótipos CTC con una alta tasa de recuperación y especificidad. El protocolo describe el uso óptimo del dispositivo microfluídico espiral para recoger los CTC, los ensayos IF optimizados que se pueden personalizar según el tipo de cáncer, y el uso de software libre de código abierto para medir y analizar imágenes celulares para realizar una numeración de las células según la tinción fluorescente. Además, la multiplexación por microscopio se puede llevar a cabo dependiendo del número de filtros/marcadores fluorescentes disponibles.

Protocol

Las muestras fueron recogidas prospectivamente en el marco de la cohorte CIRCAN (“CIRculating CANcer”) con sede en el Hospital Universitario de Lyon tras el consentimiento por escrito del paciente. Este estudio se integró en la cohorte CIRCAN_ALL. El estudio CIRCAN_ALL fue reconocido como no intervencionista por el CPP South-East IV de fecha 04/11/2015 bajo la referencia L15-188. Una versión modificada fue reconocida como no intervencionista el 20/09/2016 bajo la referencia L16-160. El estudio CIRCAN_ALL fue declarado …

Representative Results

El primer requisito previo fue obtener colecciones no contaminadas (sin agentes infecciosos) de CTC según el cultivo de tejidos y evitar los antecedentes IF generados. El protocolo de descontaminación permitió la limpieza de todas las tuberías y bombas, y dio lugar a la recogida de CTCs con una buena tasa de recuperación sin contaminación bacteriana. Las muestras enriquecidas se compararon sin y con el flujo de trabajo del protocolo de descontaminación del dispositivo microfluídico espiral. Para validar el protoc…

Discussion

En el presente estudio se plantearon dos puntos importantes, el primero en lo que respecta al rendimiento del flujo de trabajo para su transferencia a aplicaciones clínicas, y el segundo relativo a la disminución de la subjetividad para el análisis de las imágenes de fluorescencia obtenidas.

Inicialmente se determinó un flujo de trabajo optimizado y de rendimiento para la enumeración CTC mediante el ensayo IF personalizable después del enriquecimiento celular a través de un sistema mic…

Materials

4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Ozyme	BLE 422801	Storage conditions: +4°C
BD Facs Clean – 5L	BD Biosciences	340345	Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature
Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL	Biolidics	CBB-F016012	Bleach. Storage conditions: Room temperature
Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5%	Sigma	A8412	Storage conditions: +4°C
CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647	BioLegend	BLE304020	Storage conditions: +4°C
CellProfiler Software	Broad Institute		Image Analysis Software
Centrifuge device	Hettich	4706	Storage conditions: Room temperature
Centrifuge tube 50 mL	Corning	430-829	Storage conditions: Room temperature
Centrifuge Tube 15 mL	Biolidics	CBB-F001004-25	Storage conditions: Room temperature
ClearCell FX-1 System	Biolidics	CBB-F011002	Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature
Coulter Clenz Cleaning Agent – 5L	Beckman Coulter	8448222	All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature
CTChip FR1S	Biolidics	CBB-FR001002	Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature
Cytospin 4	ThermoFisher	A78300003	Storage conditions: Room temperature
Diluent Additive Reagent – 20 mL	Biolidics	CBB-F016009	Storage conditions: +4°C
EZ Cytofunnels	ThermoFisher	A78710003	Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature
FcR blocking Agent	Miltenyi Biotec	130-059-901	Storage conditions: +4°C
Fetal Calf Serum (FCS)	Gibco	10270-106	Storage conditions: +4°C
Fluoromount	Sigma	F4680	Mounting solution. Storage conditions: Room temperature
Fungizone – 50 mg	Bristol-Myers-Squibb	90129TB29	Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4°C
FX1 Input Straw with lock cap	Biolidics	CBB-F013005	Straw. Storage conditions: Room temperature
KovaSlide	Dutscher	50126	Chambered slide. Storage conditions: Room temperature
PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488	ThermoFisher	53-9003-80	Storage conditions: +4°C
Paraformaldehyde 16%	ThermoFisher	11490570	Fixation solution. Storage conditions: +4°C
PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) – Phycoerythrin	BioLegend	BLE329706	Storage conditions: +4°C
Petri Dish	Dutscher	632180	Storage conditions: Room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Ozyme	BE17-512F	Storage conditions: +4°C
Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1X – 1L	1st Base Laboratory	BUF-2040-1X1L	Storage conditions: Room temperature
Pluronic F-68 10%	Gibco	24040-032	Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature
Polylysine slides	ThermoFisher	J2800AMNZ	Storage conditions: Room temperature
Polypropylene Conical Tube 50 mL	Falcon	352098	Storage conditions: Room temperature
RBC Lysis Buffer – 100 mL	G Biosciences	786-649	Storage conditions: +4°C
RBC Lysis Buffer – 250 mL	G Biosciences	786-650	Storage conditions: +4°C
Resuspension Buffer (RSB)	Biolidics	CBB-F016003	Storage conditions: +4°C
Shandon Cytopsin4 centrifuge	ThermoFisher	A78300003	Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature
Silicon Isolator	Grace bio-Labs	664270	Storage conditions: Room temperature
Sterile Deionized Water – 100 mL	1st Base Laboratory	CUS-4100-100ml	Storage conditions: Room temperature
Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1	Zeiss		Storage conditions: Room temperature
Surgical Sterile Bag	SPS Laboratoires	98ULT01240	Storage conditions: Room temperature
Syringe BD Discardit II 20 mL sterile	BD Biosciences	300296	Storage conditions: Room temperature
Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile	ClearLine	51732	Storage conditions: Room temperature
Zen lite 2.3 Lite Software	Zeiss		Microscope associated software