Caracterização e enumeração semiautomáticas de PD-L1 de células tumorais circulantes de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas por imunofluorescência

Summary

A caracterização de células tumorais circulantes (CTCs) é um tema popular na pesquisa translacional. Este protocolo descreve um ensaio semiautomático da imunofluorescência (se) para a caracterização do PD-L1 e a enumeração dos CTCs em amostras pacientes do cancro do pulmão da não-pequena pilha (NSCLC).

Abstract

As células tumorais circulantes (CTCs) derivadas do tumor primário são derramadas na corrente sanguínea ou no sistema linfático. Estas pilhas raras (1 − 10 pilhas por o mL do sangue) justificam um prognóstico pobre e são correlacionadas com a sobrevivência total mais curta em diversos cancros (por exemplo, peito, próstata e colorectal). Atualmente, o sistema de captura de CTC com base em talão magnético anti-EpCAM é o teste padrão ouro aprovado pela administração de alimentos e drogas dos EUA (FDA) para enumerar CTCs na corrente sanguínea. Este teste é baseado no uso de grânulos magnéticos revestidos com os marcadores anti-EpCAM, que visam especificamente as células cancerosas epiteliais. Muitos estudos têm ilustrado que EpCAM não é o marcador ideal para a detecção de CTC. De fato, os CTCs são uma subpopulação heterogênea de células cancerosas e são capazes de sofrer uma transição epitelial-mesenquimais (EMT) associada à proliferação e invasão metastáticas. Estes CTCs são capazes de reduzir a expressão do marcador epitelial de superfície celular EpCAM, enquanto aumentam os marcadores mesenquimais como vimentina. Para abordar este obstáculo técnico, outros métodos de isolamento baseados em propriedades físicas de CTCs foram desenvolvidos. As tecnologias microfluidic permitem uma aproximação Label-Free ao enriquecimento de CTC das amostras de sangue inteiras. A tecnologia microfluídico espiral usa as forças de arrasto inercial e Dean com fluxo contínuo em canais curvados gerados dentro de um chip microfluídico espiral. As células são separadas com base nas diferenças de tamanho e plasticidade entre as células sanguíneas normais e células tumorais. Este protocolo detalha as etapas diferentes para caracterizar a expressão programada do Death-ligand 1 (PD-L1) dos CTCs, combinando um dispositivo microfluídicos espiral com o conjunto de marcador customizável da imunofluorescência (if).

Introduction

Os linfócitos T citotóxicos antígeno-específicos do tumor (CTLs) jogam um papel crucial na resposta aos cancros através de um processo sabido como o cancer “fiscalização imune”. Suas funções antitumorais são reforçadas por anticorpos imunológicos de bloqueio de ponto de verificação, como inibidores da CTLA-4 e inibidores da PD-1/PD-L1. No câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), as terapias anti-PD-1/PD-L1 resultam em taxas de resposta variando de 0%-17% em pacientes com tumores PD-L1-negativos e 36%-100% naqueles que expressam PD-L1. As respostas robustas ao bloqueio PD-1/PD-L1 observadas no melanoma e no NSCLC são mostradas pela evidência da taxa de resposta global melhorada (RR), dos benefícios clínicos duráveis, e da sobrevivência livre de progressão (PFS). Actualmente, os tratamentos PD1 são o padrão de cuidados no tratamento com NSCLC de segunda linha com nivolumab, independentemente da expressão PD-L1 e com pembrolizumab em doentes que expressam PD-L1 ≥ 1%. No tratamento de primeira linha, o padrão de cuidado é pembrolizumab isoladamente em pacientes com NSCLC expressando PD-L1 ≥ 50% e pode ser potencialmente reforçada com quimioterapia (platina e droga de dúvida dependendo do subtipo histológico)^1,2.

Entretanto, tal aproximação à gerência paciente é discutível³, desde que a expressão de PD-L1 em pilhas do tumor por immunohistochemistry (IHC) é provavelmente não o Biomarker o mais ideal do companheiro. Outros, como a carga de mutação tumoral⁴ (TMB), a instabilidade de MICROSSATÉLITES (MSI) e/ou a microbiota são possivelmente interessantes neste ajuste isoladamente ou em combinação. NSCLC é sabido para ser tumores heterogêneos, ou espacialmente (de um local do tumor a um outro) ou temporally (do diagnóstico ao retorno). Os pacientes com NSCLC são geralmente frágeis, e as biópsias invasoras iterativas do tecido podem ser uma edição. Na verdade, a taxa de re-biópsia na primeira progressão varia de 46%-84%, dependendo da série, e a re-biópsia bem-sucedida (significado com análise histológica e completa molecular) varia de 33%-75%. Isso significa que 25%-67% dos pacientes não podem receber uma análise de re-biópsia abrangente durante a primeira progressão^5,6,7,8.

O advento das “biópsias líquidas” gerou assim um entusiasmo considerável neste cenário particular, pois possibilita uma reavaliação crucial das alterações moleculares durante a progressão da doença, examinando o DNA livre circulante (cfDNA) derivado da circulação células tumorais (CTCs). Estas células vivem são liberados do tumor para a corrente sanguínea, onde circulam livremente. Embora não seja rotineiramente utilizado, a análise de CTCs parece ser altamente promissora no caso de caracterização molecular e fenotípica, prognóstico e significância preditiva no câncer de pulmão (via Dnaseq, Rnaseq, Mirna e análise proteica). Certamente, os CTCs provavelmente abrigam características fenotípicas da doença ativa um pouco do que os marcadores iniciais (detectados em biópsias do tecido no diagnóstico). Além disso, os CTCs contorneam o problema da heterogeneidade espacial do tecido do tumor, que pode ser uma edição crucial em biópsias pequenas. Consequentemente, a expressão de PD-L1 em CTCs pode potencialmente lançar luz sobre as discrepâncias derivadas de seu uso como um biomarcador preditivo usando tecido tumoral.

Recentemente, a expressão PD-L1 foi testada em CTCs do NSCLC. Quase todos os pacientes testados⁹ foram positivos para PD-L1, complicando a interpretação do resultado e seu uso clínico. Em geral, os CTCs PD-L1-positivos foram detectados em 69,4% das amostras de uma média de 4,5 células/mL¹⁰. Após o início da radioterapia, a proporção de CTCs PD-L1-positivas aumentou significativamente, indicando a upregulação da expressão de PD-L1 em resposta à radiação¹¹. Daqui, a análise do CTCs PD-L1 pode ser usada para monitorar mudanças dinâmicas do tumor e da resposta imune, que podem refletir a resposta à quimioterapia, à radiação, e aos tratamentos prováveis da imunoterapia (TI).

Até o momento, o isolamento CTCs e a caracterização PD-L1 dependem de vários métodos, como captura de CTC com base em talão magnético revestido com anti-epcam, ensaio baseado em enriquecimento e com base em tamanho de^12,13 ensaios de captura de CTC. Entretanto, os CTCs foram detectados somente em 45%-65% dos pacientes com NSCLC metastático, limitando assim sua habilidade de fornecer toda a informação para mais do que a metade de pacientes metastáticos de NSCLC. Além, a contagem do CTC era baixa em a maioria destes estudos usando a aproximação tamanho-baseada¹⁰. Além disso, este método conduziu às discrepâncias tais como a deteção de pilhas de CD45 (-)/DAPI (+) com “testes padrões citomorfológicos da malignidade” na circulação sanguínea de doadores saudáveis. Estas preocupações destacam a necessidade de um método altamente sensível de coleta de CTC associado à imuno-fenotipagem de células CD45 (-) atípicas de sangue total saudável usando biomarcadores adicionais de câncer (i.e., TTF1, Vimentin, EpCAM e CD44) no NSCLC.

Consequentemente, avaliamos um dispositivo microfluídico espiral que utiliza forças de arrasto inercial e Dean para separar as células com base no tamanho e na plasticidade através de um chip microfluídico. A formação de fluxos de vórtice Dean presente nos resultados de chip microfluídico em CTCs maiores localizados ao longo da parede interna e células imunes menores ao longo da parede externa do chip. O processo de enriquecimento é completado por desviando as células maiores na tomada de coleta como a fração de CTC enriquecida. Este método é particularmente sensível e específico (detecção de cerca de 1 CTC/mL de sangue total)¹⁴ e pode ser associado a análises de imunofluorescência (if) personalizadas. Estas ferramentas permitirão a criação de um limiar positivo para a interpretação clínica. Um fluxo de trabalho é descrito assim que permite que os biólogos isolem e immunophenotype CTCs com uma taxa elevada de recuperação e de especificidade. O protocolo descreve o uso ideal do dispositivo microfluídico espiral para coletar CTCs, os ensaios otimizados IF que podem ser personalizados de acordo com o tipo de câncer, e o uso de software livre de código aberto para medir e analisar imagens de células para executar um semiautomático numeração das células de acordo com a coloração fluorescente. Além disso, a multiplexação por microscópio pode ser realizada dependendo do número de filtros/marcadores fluorescentes disponíveis.

Protocol

As amostras foram coletadas prospectivamente no âmbito da coorte CIRCAN (“câncer circulante”) com base no hospital universitário de Lyon, após o consentimento por escrito do paciente. Este estudo foi integrado na coorte CIRCAN_ALL. O estudo CIRCAN_ALL foi reconhecido como não intervencionista pelo CPP sudeste IV datado de 04/11/2015 a referência L15-188. Uma versão alterada foi reconhecida como não intervencionista em 20/09/2016 a referência L16-160. O estudo CIRCAN_ALL foi declarado ao IT e ao correspondente da…

Representative Results

O primeiro pré-requisito foi a obtenção de coleções não contaminadas (sem agente infeccioso) de CTCs para cultura tecidual e evitar o fundo IF gerado. O protocolo de descontaminação permitiu a limpeza de todos os tubos e bombas, e resultou na coleta de CTCs com uma boa taxa de recuperação sem contaminação bacteriana. As amostras enriquecidas foram comparadas sem e com o fluxo de trabalho do protocolo de descontaminação do dispositivo microfluídico espiral. Para validar o protocolo de descontaminação, uti…

Discussion

Dois pontos principais foram levantados no presente estudo, o primeiro com relação ao desempenho do fluxo de trabalho para sua transferência para aplicações clínicas, e o segundo referente à diminuição da subjetividade para a análise das imagens de fluorescência obtidas.

Um fluxo de trabalho performant e aperfeiçoado para A enumeração CTC foi determinado inicialmente usando o teste customizável do If após o enriquecimento da pilha através de um sistema microfluídicos Label-Fr…

Materials

4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Ozyme	BLE 422801	Storage conditions: +4°C
BD Facs Clean – 5L	BD Biosciences	340345	Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature
Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL	Biolidics	CBB-F016012	Bleach. Storage conditions: Room temperature
Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5%	Sigma	A8412	Storage conditions: +4°C
CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647	BioLegend	BLE304020	Storage conditions: +4°C
CellProfiler Software	Broad Institute		Image Analysis Software
Centrifuge device	Hettich	4706	Storage conditions: Room temperature
Centrifuge tube 50 mL	Corning	430-829	Storage conditions: Room temperature
Centrifuge Tube 15 mL	Biolidics	CBB-F001004-25	Storage conditions: Room temperature
ClearCell FX-1 System	Biolidics	CBB-F011002	Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature
Coulter Clenz Cleaning Agent – 5L	Beckman Coulter	8448222	All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature
CTChip FR1S	Biolidics	CBB-FR001002	Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature
Cytospin 4	ThermoFisher	A78300003	Storage conditions: Room temperature
Diluent Additive Reagent – 20 mL	Biolidics	CBB-F016009	Storage conditions: +4°C
EZ Cytofunnels	ThermoFisher	A78710003	Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature
FcR blocking Agent	Miltenyi Biotec	130-059-901	Storage conditions: +4°C
Fetal Calf Serum (FCS)	Gibco	10270-106	Storage conditions: +4°C
Fluoromount	Sigma	F4680	Mounting solution. Storage conditions: Room temperature
Fungizone – 50 mg	Bristol-Myers-Squibb	90129TB29	Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4°C
FX1 Input Straw with lock cap	Biolidics	CBB-F013005	Straw. Storage conditions: Room temperature
KovaSlide	Dutscher	50126	Chambered slide. Storage conditions: Room temperature
PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488	ThermoFisher	53-9003-80	Storage conditions: +4°C
Paraformaldehyde 16%	ThermoFisher	11490570	Fixation solution. Storage conditions: +4°C
PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) – Phycoerythrin	BioLegend	BLE329706	Storage conditions: +4°C
Petri Dish	Dutscher	632180	Storage conditions: Room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Ozyme	BE17-512F	Storage conditions: +4°C
Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1X – 1L	1st Base Laboratory	BUF-2040-1X1L	Storage conditions: Room temperature
Pluronic F-68 10%	Gibco	24040-032	Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature
Polylysine slides	ThermoFisher	J2800AMNZ	Storage conditions: Room temperature
Polypropylene Conical Tube 50 mL	Falcon	352098	Storage conditions: Room temperature
RBC Lysis Buffer – 100 mL	G Biosciences	786-649	Storage conditions: +4°C
RBC Lysis Buffer – 250 mL	G Biosciences	786-650	Storage conditions: +4°C
Resuspension Buffer (RSB)	Biolidics	CBB-F016003	Storage conditions: +4°C
Shandon Cytopsin4 centrifuge	ThermoFisher	A78300003	Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature
Silicon Isolator	Grace bio-Labs	664270	Storage conditions: Room temperature
Sterile Deionized Water – 100 mL	1st Base Laboratory	CUS-4100-100ml	Storage conditions: Room temperature
Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1	Zeiss		Storage conditions: Room temperature
Surgical Sterile Bag	SPS Laboratoires	98ULT01240	Storage conditions: Room temperature
Syringe BD Discardit II 20 mL sterile	BD Biosciences	300296	Storage conditions: Room temperature
Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile	ClearLine	51732	Storage conditions: Room temperature
Zen lite 2.3 Lite Software	Zeiss		Microscope associated software