In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction (en)
Summary
Cet article représente un analyse in vitro utile pour évaluer la capacité du milieu conditionné des cellules de tumeur pour attirer des macrophages.
Abstract
Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) représentent un grand pourcentage de cellules dans la masse tumorale pour différents types de cancers. Glioblastoma (GBM), une tumeur maligne de cerveau sans traitement, a jusqu’à la moitié de la masse tumorale TAMs. Les TAM peuvent être pro-tumoral ou anti-tumoral, selon l’activation de gènes spécifiques dans les cellules. Les mutations génétiques dans les tumeurs, par la régulation de l’expression cytokine, peuvent affecter le recrutement de TAMs au microenvironnement de tumeur. Ici, nous décrivons un essai cellulaire quantitatif pour évaluer le recrutement de macrophage par le milieu conditionné des cellules de tumeur. Cet exemple utilise la lignée cellulaire de macrophage humain MV-4-11 pour étudier l’attraction du macrophage par le milieu conditionné du glioblastome, ce qui permet une reproductibilité élevée et une faible variabilité. Les données générées avec cet analyse peuvent contribuer à une meilleure compréhension de l’interaction entre la tumeur et le microenvironnement tumoral. Des résultats similaires peuvent être utilisés pour évaluer l’interaction entre les cellules tumorales et d’autres cellules immunitaires, y compris les lymphocytes T et les cellules tueuses naturelles (NK).
Introduction
Les macrophages sont des cellules immunitaires à haute hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle1. Ils jouent des rôles importants dans les systèmes de défense hôte, la réparation des tissus, le développement et la progression tumorale1. Les TAM sont des macrophages dans le microenvironnement des tumeurs solides. Certains TAMs peuvent favoriser la croissance de tumeur en inhibant l’activité cytotoxique T cellule-négociée, modulant le microenvironnement de tumeur (TME), favorisant l’angiogenèse, l’invasion et la métastasie2,3,4, 5. Les TAMsont parmi les types de cellules les plus abondants dans le TME et lenombre plus élevé de TAMs est généralement corrélé avec la survie plus mauvaise patiente dans beaucoup de types de tumeurs pleines 6. Les signatures génétiques distinctes des cellules tumorales affectent leur capacité à recruter des macrophages. Dans GBM, une tumeur cérébrale agressive sans traitement, les macrophages peuvent représenter jusqu’à la moitié de la masse tumorale7. La co-amplification du récepteur épidermique de facteur de croissance (EGFR) et de son EGFRvIII mutant de truncation est fréquemment observée dans GBM, qui confère des avantages de croissance de tumeur8. Les cellules co-exprimant EGFR et EGFRvIII attirent plus de macrophages que les cellules exprimant EGFR ou EGFRvIII individuellement7.
Chemokines sont une famille de petites cytokines qui jouent un rôle important dans la régulation de la composition immunitaire dans le TME6,9. Les cellules humaines expriment plus de 50 cytokines10. L’infiltration immunitaire dans les tumeurs est largement réalisée par l’interaction entre les cytokines et les récepteurs cytokine11. Chaque type de cellules immunitaires exprime des récepteurs chimiokine distincts/chemokines et peut être recruté par des cellules sécrétant des chimiokines spécifiques/récepteurs de chimiokine12. Les cellules cancéreuses peuvent augmenter l’expression de certaines chimiocines pour recruter des cellules immunitaires telles que les TAM, les lymphocytes T régulateurs et les cellules suppressrices dérivées du myéloïde (MDSC)6. Le blocus de la chimiokine spécifique sécrétée par les tumeurs peut être un moyen prometteur en inhibant l’infiltration des cellules immunitaires dans la masse tumorale.
Ici, nous décrivons un protocole qui permet l’évaluation in vitro de l’interaction tumeur-macrophage, utilisant les médias conditionnés des cellules de tumeur contenant des chemokines et des lignées de cellules de macrophage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, il y a plusieurs étapes clés : 1) sélection de l’insert Transwell. Pour la lignée cellulaire MV-4-11, les inserts Transwell de 5 m fonctionnent bien. Cependant, pour d’autres lignées cellulaires telles que la lignée cellulaire de monocytes THP-1 couramment utilisée, une taille de pores différente pourrait mieux fonctionner. 2) Comme différentes lignées cellulaires se développent à des vitesses différentes, il est important d’ajuster le volume des supports conditionnés en fonction du nombr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Soutien aux subventions : Z. An a reçu le soutien d’Alex’s Lemonade Stand Foundation, de l’American Brain Tumor Association, du NIH T32CA108462 et du Program for Breakthrough Biomedical Research, qui est partiellement financé par la Sandler Foundation. W. Weiss a reçu l’appui des subventions des NIH R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103; la Samuel G. Waxman Cancer Research Foundation; et la chaise Evelyn et Mattie Anderson.
Materials
| 0.1 μm filtration cup | Thermo fisher | 566-0010 | |
| 0.45 μm filter unit | Millipore | SLHA033SS | |
| 10 mL serological pipettes | Olympus plastics | 12-104 | |
| 15mL sterile centrifuge tubes | Olympus plastics | 28-103 | |
| 1 mL pipette tip | ART molecular bioproducts | 2779-RI | |
| 2 mL aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
| 24-well plate | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 4x lysis buffer | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 5 μm Transwell insert | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 75cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| B27 | Gibco | 12587-010 | |
| CyQuant Dye | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 10565-018 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| FGF | Peprotech | 100-18B | |
| IMDM | Gibco | 12440-053 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypan blue | Biorad | 1450021 |
References
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