In vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim
Summary
Bu makalede, makrofajlar çekmek için tümör hücrelerinden şartlık orta yeteneğini değerlendirmek için yararlı bir in vitro tahlil temsil eder.
Abstract
Tümör ilişkili makrofajlar (TAMs) kanserlerin farklı türleri için tümör kitlesinde hücrelerin büyük bir yüzdesi için hesap. Glioblastoma (GBM), hiçbir tedavi ile malign bir beyin tümörü, bir buçuk tümör kitle TAMs vardır. TAMs hücrelerde belirli genlerin aktivasyonuna bağlı olarak, tümör yanlısı veya anti-tümör olabilir. Tümörlerde genetik mutasyonlar, sitokin ifadesinin düzenlenmesi yoluyla, TAMs ‘in tümör mikroortamına alınmasını etkileyebilmektedir. Burada, biz tümör hücrelerinden şartlandıran orta makrophaj işe değerlendirmek için bir nicel hücre tabanlı tahlil tarif. Bu tahlil, yüksek yeniden üretilebilirlik ve düşük değişkenlik için izin glioblastoma tarafından şartlanabilir medyası tarafından makrophaj cazibe çalışması için MV-4-11 insan makrophage hücre hattı kullanır. Bu tahlil ile oluşturulan veriler, tümör ve tümör mikroçevre arasındaki etkileşimin daha iyi anlaşılması için katkıda bulunabilir. Benzer tahlil tümör hücreleri ve diğer bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimi değerlendirmek için kullanılabilir, T hücreleri ve doğal katil (NK) hücreleri de dahil olmak üzere.
Introduction
Macrofajlar yüksek fenotürik ve fonksiyonel heterojenite ile bağışıklık hücrelerdir1. Onlar ana savunma sistemleri, doku tamiri, geliştirme ve tümör ilerlemesi1önemli roller oynar. TAMs, Solid tümörlerin mikroortamında macrofajlar. Bazı Tams T hücre aracılı sitotoksisik aktivite inhibe ederek tümör büyümesini teşvik edebilir, tümör mikroçevre modülasyon (TME), anjiyojenezi teşvik, invazyon ve metasfik2,3,4, 5. Tams en bol hücre TÜRLERI arasında TME ve Tams yüksek sayıda genellikle katı tümörlerin birçok türde kötü hasta hayatta kalma ile ilişkilidir6. Tümör hücrelerinin farklı genetik imzaları makrofajlar işe yeteneklerini etkiler. GBM ‘de hiçbir çare olmayan agresif bir beyin tümörü olan makrofajlar, tümör kitlesi7‘ nin yarısını gösterebilir. Epidermal büyüme faktörü reseptörünün (EGFR) ve kesilmesi mutant egfrvııı ‘in eş amplifikasyonu, tümör büyüme avantajlarını8‘ e getiren GBM ‘de sıklıkla görülür. EGFR ve Egfrvııı ‘e eş ifade eden hücreler, EGFR veya Egfrvııı ‘i ifade eden hücrelere kıyasla daha fazla makrofajları çeker7.
Kemokinler, TME6,9‘ da bağışıklık bileşiminin düzenleniminde önemli roller oynayan küçük sitokinlerin bir ailesdir. İnsan hücreleri 50 ‘ den fazla sitokinler10ifade eder. Tümörlerde bağışıklık infiltrasyonu büyük ölçüde sitokinler ve sitokin reseptörleri arasındaki etkileşim tarafından gerçekleştirilir11. Bağışıklık hücrelerinin her türü farklı kemokin reseptörleri ifade/kemokinler ve belirli chemokines salgılar hücreler tarafından işe alınabilir/kemokin reseptörleri12. Kanser hücreleri, TAMs, düzenleyici T hücreleri ve myeloid türeyen bastırıcı hücreler (MDSCs)6gibi bağışıklık hücrelerini işe almak için belirli kemokinler ifadesini artırabilir. Tümörler tarafından salgılanan spesifik kemokinin blokajı, bağışıklık hücrelerinin tümör kitlesine infiltrasyonunun inhibe edilmesi konusunda umut verici bir yol olabilir.
Burada, tümör-makrophaj etkileşiminin in vitro olarak değerlendirilmesine izin veren bir protokol tanımlamakta, kemokinler ve makrophaj hücre hatları içeren tümör hücrelerinden şartların kullanıldığı medyayı kullanarak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde, birkaç anahtar adım vardır: 1) Transwell ekleme seçimi. MV-4-11 hücre hattı için 5 μm Transwell ekler iyi çalışır. Ancak, sık kullanılan monoksit hücre çizgisi THP-1 gibi diğer hücre çizgileri için farklı bir gözenek boyutu daha iyi çalışabilir. 2) farklı hücre hatları farklı hızlarda büyüyünce, hücre numaralarına göre şartlı medyanın hacmini ayarlamak önemlidir. Bu amaçla, aynı deneysel koşullar altında kuluzlanmış hücre içermeyen medya, şartlı medyayı se…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grant destek: Z. Alex ‘in limonata stand Vakfı, Amerikan beyin tümörü Derneği, NıH T32CA108462 ve program çığır açan Biyomedikal araştırma, kısmen Sandler Vakfı tarafından finanse edilen bir destek aldı. W. Weiss NıH hibe R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103 tarafından destekleniyordu; Samuel G. Waxman Kanser Araştırma Vakfı; ve Evelyn ve Mattie Anderson koltuğu.
Materials
| 0.1 μm filtration cup | Thermo fisher | 566-0010 | |
| 0.45 μm filter unit | Millipore | SLHA033SS | |
| 10 mL serological pipettes | Olympus plastics | 12-104 | |
| 15mL sterile centrifuge tubes | Olympus plastics | 28-103 | |
| 1 mL pipette tip | ART molecular bioproducts | 2779-RI | |
| 2 mL aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
| 24-well plate | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 4x lysis buffer | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 5 μm Transwell insert | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 75cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| B27 | Gibco | 12587-010 | |
| CyQuant Dye | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 10565-018 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| FGF | Peprotech | 100-18B | |
| IMDM | Gibco | 12440-053 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypan blue | Biorad | 1450021 |
References
- Liu, Y., Cao, X. The origin and function of tumor-associated macrophages. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 1-4 (2015).
- Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, (2014).
- Coussens, L. M., Zitvogel, L., Palucka, A. K. Neutralizing tumor-promoting chronic inflammation: a magic bullet. Science. 339 (6117), 286-291 (2013).
- Tsukamoto, H., et al. Combined Blockade of IL6 and PD-1/PD-L1 Signaling Abrogates Mutual Regulation of Their Immunosuppressive Effects in the Tumor Microenvironment. 癌症研究. 78 (17), 5011-5022 (2018).
- Borgoni, S., et al. Depletion of tumor-associated macrophages switches the epigenetic profile of pancreatic cancer infiltrating T cells and restores their anti-tumor phenotype. Oncoimmunology. 7 (2), e1393596 (2018).
- Argyle, D., Kitamura, T. Targeting Macrophage-Recruiting Chemokines as a Novel Therapeutic Strategy to Prevent the Progression of Solid Tumors. Frontiers in Immunology. 9, 2629 (2018).
- An, Z., et al. EGFR cooperates with EGFRvIII to recruit macrophages in glioblastoma. 癌症研究. , (2018).
- Fan, Q. W., et al. EGFR phosphorylates tumor-derived EGFRvIII driving STAT3/5 and progression in glioblastoma. Cancer Cell. 24 (4), 438-449 (2013).
- Jacquelot, N., Duong, C. P. M., Belz, G. T., Zitvogel, L. Targeting Chemokines and Chemokine Receptors in Melanoma and Other Cancers. Frontiers in Immunology. 9, 2480 (2018).
- Arimont, M., et al. Structural Analysis of Chemokine Receptor-Ligand Interactions. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (12), 4735-4779 (2017).
- Turner, M. D., Nedjai, B., Hurst, T., Pennington, D. J. Cytokines and chemokines: At the crossroads of cell signalling and inflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (11), 2563-2582 (2014).
- Sokol, C. L., Luster, A. D. The chemokine system in innate immunity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (5), (2015).
- Pathria, P., Louis, T. L., Varner, J. A. Targeting Tumor-Associated Macrophages in Cancer. Trends in Immunology. 40 (4), 310-327 (2019).
- Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 399-416 (2017).
