In Vitro Analisi per studiare l'interazione tumora-macrophage

Summary

Questo articolo rappresenta un utile saggio in vitro per valutare la capacità del mezzo condizionato dalle cellule tumorali per attirare i macrofagi.

Abstract

I macrofagi associati al tumore (TAM) rappresentano una grande percentuale di cellule nella massa tumorale per diversi tipi di cancro. Glioblastoma (GBM), un tumore maligno al cervello senza cura, ha fino a metà dei ARM di massa tumorale. I TAM possono essere pro-tumorale o anti-tumorale, a seconda dell’attivazione di geni specifici nelle cellule. Le mutazioni genetiche nei tumori, attraverso la regolazione dell’espressione della citochina, possono influenzare il reclutamento di TAM nel microambiente tumorale. Qui, descriviamo un saggio quantitativo basato sulle cellule per valutare il reclutamento di macrofaci da parte del mezzo condizionato dalle cellule tumorali. Questo analisi utilizza la linea cellulare del macrofago umano MV-4-11 per studiare l’attrazione dei macrofazaggi da parte del mezzo condizionato dal glioblastoma, consentendo un’elevata riproducibilità e bassa variabilità. I dati generati con questo saggio possono contribuire a una migliore comprensione dell’interazione tra il tumore e il microambiente tumorale. Un saggio simile può essere usato per valutare l’interazione tra le cellule tumorali e altre cellule immunitarie, comprese le cellule T e le cellule killer naturali (NK).

Introduction

I macrofagi sono cellule immunitarie con un’elevata eterogeneità fenotipica e funzionale¹. Essi svolgono ruoli importanti nei sistemi di difesa ospite, riparazione dei tessuti, sviluppo e progressione del tumore¹. I TAM sono macrofagi nel microambiente dei tumori solidi. Alcuni TAM possono promuovere la crescita tumorale inibendo l’attività citotossica mediata dalle cellule T, modulando il microambiente tumorale (TME), promuovendo l’angiogenesi, l’invasione e la metastasi^{2,3,4, 5}. I TAM sono tra i tipi di cellule più abbondanti nel TME e un numero più elevato di TAM in genere è correlato alla peggiore sopravvivenza del paziente in molti tipi di tumori solidi⁶. Le distinte firme genetiche delle cellule tumorali influenzano la loro capacità di reclutare macrofagi. In GBM, un tumore cerebrale aggressivo senza cura, i macrofagi possono rappresentare fino alla metà della massa tumorale⁷. La coamplificazione del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) e del suo mutante di troncamento EGFRvIII è frequentemente osservata in GBM, che conferisce vantaggi di crescita tumorale⁸. Le cellule che coeprimono EGFR ed EGFRvIII attraggono più macrofagi rispetto alle cellule che esprimono EGFR o EGFRvIII da poco^.

Le chemiochine sono una famiglia di piccole citochine che svolgono un ruolo significativo nella regolazione della composizione immunitaria nel TME^6,9. Le cellule umane esprimono più di 50 citochine¹⁰. L’infiltrazione immunitaria nei tumori è in gran parte realizzata dall’interazione tra citochine e recettori citochine¹¹. Ogni tipo di cellule immunitarie esprime recettori chemiochine distinti/ chemiochine e può essere reclutato da cellule che secernono chemiochine specifiche / recettori chemiochine¹². Le cellule tumorali possono aumentare l’espressione di alcune chemiochine per reclutare cellule immunitarie come TAM, cellule T regolatorie e cellule soppressori derivate da mieloidi (MDSC)⁶. Il blocco della chemiochina specifica secreta dai tumori può essere un modo promettente per inibire l’infiltrazione delle cellule immunitarie nella massa del tumore.

Qui, descriviamo un protocollo che consente la valutazione in vitro dell’interazione tumora-macrofago, utilizzando supporti condizionati dalle cellule tumorali contenenti chemiochine e linee cellulari di macrofago.

Protocol

1. Preparazione media Preparazione del mezzo di cellule staminali senza siero Scongelare il supplemento 50x B27, il fattore di crescita epidermico (EGF, 20 g/mL in acido acetico 10 mM con 0,1% BSA) e il fattore di crescita del fibroblasto (FGF, 20g/mL in 10 m di acido acetico con 0,1% BSA). Aggiungere 500 l di EGF (concentrazione finale 20 ng/mL), 500 lof di FGF (concentrazione finale 20 ng/mL), 10 mL da 50x B27 a 500 mL di Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture…

Representative Results

I risultati sono di solito mostrati tramite grafici a barre (esempio mostrato Figura 1). I campioni con valori elevati di 480/520 indicano che il supporto condizionato ha un’elevata capacità di reclutare macrofagi. A seconda delle esigenze sperimentali, possono essere inclusi controlli aggiuntivi. Ad esempio, si possono usare anticorpi neutralizzanti per trattare i media condizionati per abolire il macrofalo chemiotassi, ed eseguire lo stesso saggio. Si poss…

Discussion

In questo protocollo, ci sono diversi passaggi chiave: 1) selezione dell’inserto Transwell. Per la linea cellulare MV-4-11, 5 inserti Transwell m funzionano bene. Tuttavia, per altre linee cellulari come la linea cellulare monocito comunemente usata THP-1, una dimensione diversa dei pori potrebbe funzionare meglio. 2) Man mano che linee cellulari diverse crescono a velocità diverse, è importante regolare il volume dei supporti condizionati in base ai numeri di cellulare. A tale scopo, i supporti privi di cellule incuba…

Materials

0.1 μm filtration cup	Thermo fisher	566-0010
0.45 μm filter unit	Millipore	SLHA033SS
10 mL serological pipettes	Olympus plastics	12-104
15mL sterile centrifuge tubes	Olympus plastics	28-103
1 mL pipette tip	ART molecular bioproducts	2779-RI
2 mL aspirating pipet	Falcon	357558
24-well plate	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
4x lysis buffer	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
5 μm Transwell insert	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
75cm2 flask	Corning	430641U
Accutase	Innovative cell technologies	AT-104
B27	Gibco	12587-010
CyQuant Dye	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
DMEM	Gibco	11965-092
DMEM:F12	Gibco	10565-018
EGF	Peprotech	AF-100-15
FBS	Gibco	26140
FGF	Peprotech	100-18B
IMDM	Gibco	12440-053
PBS	Gibco	14190-144
Pen Strep	Gibco	15140-122
Trypan blue	Biorad	1450021