Ensayo In Vitro para estudiar la interacción tumor-macrofago
Summary
Este artículo representa un ensayo in vitro útil para evaluar la capacidad del medio acondicionado de las células tumorales para atraer macrófagos.
Abstract
Los macrófagos asociados a tumores (AMA) representan un gran porcentaje de células en la masa tumoral para diferentes tipos de cáncer. El glioblastoma (GBM), un tumor cerebral maligno sin cura, tiene hasta la mitad de los MAAs de masa tumoral. Los AMA pueden ser pro-tumorales o antitumorales, dependiendo de la activación de genes específicos en las células. Las mutaciones genéticas en los tumores, a través de la expresión de citoquinas, pueden afectar el reclutamiento de TAM en el microambiente tumoral. Aquí, describimos un ensayo cuantitativo basado en células para evaluar el reclutamiento de macrófagos por el medio acondicionado de las células tumorales. Este ensayo utiliza la línea celular de macrófagos humanos MV-4-11 para estudiar la atracción de macrófagos por el medio acondicionado del glioblastoma, lo que permite una alta reproducibilidad y baja variabilidad. Los datos generados con este ensayo pueden contribuir a una mejor comprensión de la interacción entre el tumor y el microambiente tumoral. Ensayo similar se puede utilizar para evaluar la interacción entre las células tumorales y otras células inmunitarias, incluyendo las células T y las células asesinas naturales (NK).
Introduction
Los macrófagos son células inmunitarias con alta heterogeneidad fenotípica y funcional1. Desempeñan un papel importante en los sistemas de defensa del huésped, reparación de tejidos, desarrollo y progresión tumoral1. Los AMA son macrófagos en el microambiente de tumores sólidos. Ciertos AMA pueden promover el crecimiento tumoral mediante la inhibición de la actividad citotóxica mediada por células T, lamodulación del microambiente tumoral (TME), la promoción de la angiogénesis, invasión y metástasis 2,3,4, 5. Los AMA se encuentran entre los tipos de células más abundantes en el TME y un mayor número de AMA generalmente se correlaciona con una peor supervivencia del paciente en muchos tipos de tumores sólidos6. Las distintas firmas genéticas de las células tumorales afectan su capacidad para reclutar macrófagos. En GBM, un tumor cerebral agresivo sin cura, los macrófagos pueden representar hasta la mitad de la masa tumoral7. La coamplificación del receptor del factor de crecimiento epidérmico(EGFR)y su mutante de truncamiento EGFRvIII se observa con frecuencia en GBM, que confiere ventajas de crecimiento tumoral8. Las células que co-expresan EGFR y EGFRvIII atraen más macrófagos en comparación con las células que expresan EGFR o EGFRvIII por separado7.
Las quimioquinas son una familia de citoquinas pequeñas que desempeñan un papel importante en la regulación de la composición inmune en el TME6,9. Las células humanas expresan más de 50 citoquinas10. La infiltración inmune en los tumores se realiza en gran medida por la interacción entre las citoquinas y los receptores de citoquinas11. Cada tipo de células inmunitarias expresa distintos receptores de quimiocina/quimiocinas y puede ser reclutado por células que secretan quimiolinas específicas/receptores de quimiocina12. Las células cancerosas pueden aumentar la expresión de ciertas quimiolinas para reclutar células inmunitarias como TAC, células T reguladoras y células supresoras derivadas de mieloides (MDSC)6. El bloqueo de la quimiocina específica secretada por los tumores puede ser una forma prometedora de inhibir la infiltración de células inmunitarias en la masa tumoral.
Aquí, describimos un protocolo que permite la evaluación in vitro de la interacción tumor-macrofaje, utilizando medios acondicionados de las células tumorales que contienen quimiolinas y líneas celulares de macrófagos.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, hay varios pasos clave: 1) selección de la plaquita Transwell. Para la línea de celda MV-4-11, las plaquitas Transwell de 5 m funcionan bien. Sin embargo, para otras líneas celulares como la línea celular de monocitos comúnmente utilizada THP-1, un tamaño de poro diferente podría funcionar mejor. 2) A medida que las diferentes líneas celulares crecen a diferentes velocidades, es importante ajustar el volumen de los medios acondicionados de acuerdo con los números de celda. Para ello, se pueden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apoyo de la subvención: Z. Un recibió apoyo de Alex’s Lemonade Stand Foundation, American Brain Tumor Association, NIH T32CA108462 y Program for Breakthrough Biomedical Research, que es parcialmente financiado por la Fundación Sandler. W. Weiss fue apoyado por las subvenciones NIH R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103; la Fundación Samuel G. Waxman para la Investigación del Cáncer; y la silla Evelyn y Mattie Anderson.
Materials
| 0.1 μm filtration cup | Thermo fisher | 566-0010 | |
| 0.45 μm filter unit | Millipore | SLHA033SS | |
| 10 mL serological pipettes | Olympus plastics | 12-104 | |
| 15mL sterile centrifuge tubes | Olympus plastics | 28-103 | |
| 1 mL pipette tip | ART molecular bioproducts | 2779-RI | |
| 2 mL aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
| 24-well plate | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 4x lysis buffer | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 5 μm Transwell insert | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 75cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| B27 | Gibco | 12587-010 | |
| CyQuant Dye | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 10565-018 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| FGF | Peprotech | 100-18B | |
| IMDM | Gibco | 12440-053 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypan blue | Biorad | 1450021 |
References
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