Ensaio in vitro para estudo do tumor-interação macrófago

Summary

Este artigo representa um ensaio in vitro útil para avaliar a capacidade do meio condicionado das células tumorais para atrair macrófagos.

Abstract

Os macrófagos associados ao tumor (TAMs) respondem por uma grande porcentagem de células na massa tumoral para diferentes tipos de cânceres. Glioblastoma (GBM), um tumor cerebral maligno sem a cura, tem até uma metade da massa de tumor TAMs. Os TAMs podem ser pró-tumorais ou antitumorais, dependendo da ativação de genes específicos nas células. As mutações genéticas nos tumores, com a expressão de regulação do citocinas, podem afetar o recrutamento de Tams ao microambiente do tumor. Aqui, nós descrevemos um ensaio Cell-Based quantitativo para avaliar o recrutamento do macrófago pelo meio condicionado das pilhas do tumor. Este ensaio utiliza a linhagem celular de macrófago humano MV-4-11 para estudar a atração de macrófago pelo meio condicionado do glioblastoma, permitindo alta reprodutibilidade e baixa variabilidade. Os dados gerados com este ensaio podem contribuir para uma melhor compreensão da interação entre o tumor e o microambiente tumoral. O ensaio similar pode ser usado para avaliar a interação entre as pilhas do tumor e outras pilhas imunes, incluindo pilhas de T e pilhas naturais do assassino (NK).

Introduction

Os macrófagos são células imunes com alta heterogeneidade fenotípica e funcional¹. Desempenham papéis importantes nos sistemas de defesa do hospedeiro, reparação tecidual, desenvolvimento e progressão tumoral¹. Os TAMs são macrófagos no microambiente de tumores sólidos. Certos Tams podem promover o crescimento tumoral através da inibição da atividade citotóxica mediada por células T, modulando o microambiente tumoral (TME), promovendo a angiogênese, invasão e metástase^{2,3,4, 5}. os Tams estão entre os tipos os mais abundantes da pilha no TME e um número mais elevado de Tams correlaciona geralmente com a sobrevivência paciente mais má em muitos tipos de tumores contínuos⁶. As distintas assinaturas genéticas das células tumorais afetam sua capacidade de recrutar macrófagos. Em GBM, um tumor cerebral agressivo sem cura, os macrófagos podem representar até uma metade da massa tumoral⁷. A co-amplificação do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e seu mutante egfrviii do truncamento são observados freqüentemente em GBM, que confere vantagens do crescimento do tumor⁸. As células que coexpressam o EGFR e o EGFRvIII atraem mais macrófagos em comparação com células que expressam EGFR ou EGFRvIII isoladamente⁷.

As quimiocinas são uma família de pequenas citocinas que desempenham papéis significativos na regulação da composição imunológica no TME^6,9. As células humanas expressam mais de 50 citocinas¹⁰. A infiltração imune nos tumores é amplamente realizada pela interação entre citocinas e receptores de citocina¹¹. Cada tipo de células imunes expressa receptores de quimiocina/quimiocinas distintas e pode ser recrutado por células secretando quimiocinas específicas/receptores de quimiocina¹². As células cancerosas podem aumentar a expressão de certas quimiocinas para recrutar células imunes, tais como TAMs, células T reguladoras e células supressoras mielóides derivadas (MDSCs)⁶. O bloqueio da quimiocina específica secretada pelos tumores pode ser uma forma promissora na inibição da infiltração de células imunes na massa tumoral.

Aqui, nós descrevemos um protocolo que permita in vitro a avaliação da interação do tumor-macrófago, usando meios condicionados das pilhas do tumor que contêm quimiocinas e linhas de pilha do macrófago.

Protocol

1. preparação média Preparação do meio de células-tronco sem soro Descongelar o suplemento 50x B27, o fator de crescimento epidérmico (EGF, 20 μg/mL em ácido acético a 10 mM com 0,1% de BSA) e o fator de crescimento do fibroblasto (FGF, 20 μg/mL em ácido acético a 10 mM com 0,1% de BSA). Adicionar 500 μL de EGF (concentração final 20 ng/mL), 500 μL de FGF (concentração final 20 ng/mL), 10 mL de 50x B27 a 500 mL de Dulbecco ‘ s modificado Eagle médio/nut…

Representative Results

Os resultados são geralmente mostrados através de gráficos de barras (exemplo mostrado na Figura 1). Amostras com valores elevados de 480/520 indicam que a mídia climatizada tem alta capacidade de recrutar macrófagos. Dependendo da necessidade experimental, controles adicionais podem ser incluídos. Por exemplo, pode-se usar anticorpos neutralizantes para tratar a mídia condicionada para abolir os quimiotaxos de macrófago e realizar o mesmo ensaio. Pod…

Discussion

Neste protocolo, existem várias etapas-chave: 1) seleção da inserção Transwell. Para a linha celular MV-4-11, as inserções Transwell de 5 μm funcionam bem. No entanto, para outras linhas celulares, como a linha de células de monócitos comumente usados THP-1, um tamanho de poro diferente pode funcionar melhor. 2) porque as linhas de pilha diferentes crescem em velocidades diferentes, é importante ajustar o volume dos meios condicionados de acordo com números de pilha. Para isso, a mídia sem células incubada …

Materials

0.1 μm filtration cup	Thermo fisher	566-0010
0.45 μm filter unit	Millipore	SLHA033SS
10 mL serological pipettes	Olympus plastics	12-104
15mL sterile centrifuge tubes	Olympus plastics	28-103
1 mL pipette tip	ART molecular bioproducts	2779-RI
2 mL aspirating pipet	Falcon	357558
24-well plate	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
4x lysis buffer	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
5 μm Transwell insert	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
75cm2 flask	Corning	430641U
Accutase	Innovative cell technologies	AT-104
B27	Gibco	12587-010
CyQuant Dye	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
DMEM	Gibco	11965-092
DMEM:F12	Gibco	10565-018
EGF	Peprotech	AF-100-15
FBS	Gibco	26140
FGF	Peprotech	100-18B
IMDM	Gibco	12440-053
PBS	Gibco	14190-144
Pen Strep	Gibco	15140-122
Trypan blue	Biorad	1450021