قياس إفراز الأنسولين النسبي باستخدام بديل لوسيفيراز المفرز
Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء فحوصات لوسيفيراز سريعة منخفضة التكلفة في متوسطة الإنتاجية باستخدام غوسيا لوسيفيراز المرتبطة بالأنسولين كوكيل لإفراز الأنسولين من خلايا بيتا. يمكن إجراء الفحص مع معظم قارئات لوحة الانارة والماصات متعددة القنوات.
Abstract
إجراء الفحوصات المستندة إلى الأجسام المضادة لجمع الأنسولين المفرزة بعد العينة عادة ما يتطلب بضع ساعات إلى يوم من وقت الفحص ويمكن أن تكون مكلفة، اعتمادا على الفحص المحدد. فحوصات لوسيفيراز المفرزة تعجل النتائج وتخفض تكلفة التذوق لكل عينة بشكل كبير. هنا نقدم نهج غير المستخدمة نسبيا لقياس النشاط إفراز الأنسولين من خلايا البنكرياس بيتا باستخدام غوسيا لوسيفيراز إدراجها وراثيا داخل الببتيد C. أثناء المعالجة بروتيوليك من بروسولين, يتم استئصال الببتيد C الإفراج عن لوسيفيراز داخل الحويصلات إفراز الأنسولين حيث يتم تفرزه مع الأنسولين. يمكن الحصول على النتائج في غضون دقائق بعد جمع عينة بسبب سرعة الاختبارات لوسيفيراز. وهناك قيد من المقاييس هو أنه هو قياس نسبي لإفراز الأنسولين وليس كمية مطلقة. ومع ذلك، هذا البروتوكول هو اقتصادي، قابلة للتحجيم، ويمكن تنفيذها باستخدام معظم قارئات لوحة الإضاءة القياسية. تسهل الماصات التناظرية والرقمية متعددة القنوات خطوات متعددة من القياس. العديد من الاختلافات التجريبية المختلفة يمكن اختبارها في وقت واحد. بمجرد أن يتم تحديد مجموعة مركزة من الشروط، ينبغي قياس تركيزات الأنسولين مباشرة باستخدام الاختبارات المستندة إلى الأجسام المضادة مع منحنيات قياسية لتأكيد نتائج اختبار لوسيفيراز.
Introduction
الطريقة المعروضة هنا يسمح إفراز الأنسولين من خط خلية بيتا المعدلة وراثيا أن يتم فحصها بسرعة وبأسعار معقولة في شكل 96 لوحة جيدا. المفتاح لهذا البروتوكول هو نسخة معدلة من الأنسولين مع لوسيفيراز غوسيا بطبيعة الحال (GLuc, ~ 18 كدا) إدراجها (انظر الشكل1) في C-الببتيد لتوليد الأنسولين-غاوسيا (InsGLuc)1,2. البروتينات الأخرى الكبيرة، مثل GFP (~25 kDa)، تم إدخالها بنجاح في الببتيد C من الأنسولين وعرضت المعالجة المتوقعة بعد الترجمة من proinsulin-GFP إلى الأنسولين وGFP-C-الببتيد3،4. للكشف عن الشبهات في هذا البروتوكول، وقد تم CoLuc الأمثل للتعبير الثدييات واثنين من الطفرات قد أدخلت لتعزيز الحركية مثل توهج5،6. يمكن بسهولة اختبار تركيبات متعددة وتكرار من ظروف العلاج في شكل 96 جيدا لوحة ويمكن الحصول على نتائج إفراز مباشرة بعد التجربة.
وهناك ميزة رئيسية، كمالوحظ سابقا 2، هو انخفاض تكلفة هذا القياس إفراز القائم على لوسيفيراز ( $2/well) ومتجانسة الوقت حل فلوري (HTRF) أو غيرها من Förster نقل الطاقة الرنين (FRET) الأجسام المضادة القائمة (> $1/well) الاختبارات. بالمقارنة مع هذه الاختبارات القائمة على الأجسام المضادة، والتي تقيس تركيز الأنسولين من خلال الرجوع إلى منحنى قياسي، يقيس اختبار InsGLuc النشاط الإفرازي كمقارنة نسبية للسيطرة على الآبار على اللوحة. ولهذا السبب، تتطلب كل تجربة إدراج ضوابط مناسبة. وهذا التمييز هو مقايضة تسمح بإجراء قياسات سريعة وغير مكلفة. ومع ذلك، تم إثبات إفراز InsGLuc أن تكون مرتبطة ارتباطا وثيقا مع إفراز الأنسولين كما يقاس ELISA1،2. وقد تم توسيع نطاق هذه التكنولوجيا لفحص عالية الإنتاجية1،2،7 ، وأدى إلى تحديد المغيرات الجديدة لإفراز الأنسولين بما في ذلك مثبط قناة البوتاسيوم بوابة الجهد7 فضلا عن مثبط المنتج الطبيعي من وظيفة الخلية بيتا، الكرومومايوسين A28. استخدام InsGLuc هو الأكثر ملاءمة للباحثين الذين يخططون لاختبار باستمرار العديد من ظروف العلاج المختلفة لتأثيرها على إفراز الأنسولين. في تجارب المتابعة من الضروري تكرار النتائج الرئيسية في خط الخلية بيتا الأبوية، وعلى النحو الأمثل في المورين أو الجزر البشرية، وقياس إفراز الأنسولين باستخدام فحص الأجسام المضادة القائمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقدم هنا طريقة لتقييم استجابات إفراز الأنسولين المحفز للجلوكوز بسرعة من خلايا MIN6 β. للحصول على أفضل الردود في القياس من المهم أن البذور الخلايا MIN6 في الكثافة المناسبة والسماح لهم أن تصبح 85-95% confluent. وهذا يحسن الاستجابات الخلية β للجلوكوز بسبب تحسن اتصالات الخلية الخلوية والتزامن، والذي يح?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفون جميع الأعضاء الحاليين والسابقين في مختبر كوب على العمل والمناقشات القيمة، وديون وير على المساعدة الإدارية. مايكل كالوات مدعوم من مؤسسة أبحاث مرض السكري للأحداث SRA-2019-702-Q-R. وقد أصبح هذا العمل ممكنا من خلال المعاهد القومية للصحة R37 DK34128 ومؤسسة ويلش منحة I1243 إلى ميلاني كوب. كما تم دعم الأجزاء الأولى من هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة FK100113 لمايكل كالوات.
Materials
| Cell culture materials | |||
| rIns-GLuc stable MIN6 cells | Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 4.5 g/L glucose media |
| fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| beta-mercaptoethanol | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| glutamine | Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C. |
| T75 tissue culture flasks | Fisher Scientific | 07-202-000 | |
| 96 well tissue culture plates | Celltreat | 229196 | |
| Reagent reservoirs (50 mL) | Corning | 4870 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secretion assay reagents | |||
| BSA (RIA grade) | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific | 15568414 | |
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional drugs for stimulation experiments | |||
| Diazoxide | Sigma | D9035 | Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added. |
| epinephrine (bitartrate salt) | Sigma | E4375 | Stock solution: 5 mM in water |
| PMA (phorbol 12-myristate) | Sigma | P1585 | Stock solution: 100 µM in DMSO |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guassia assay materials | |||
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| Glycerol | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| Sodium Bromide | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | Stock solution: 0.5 M pH 8 |
| Tris base | RPI | T60040-1000.0 | Stock solution: 1 M pH 8 |
| Ascorbic Acid | Fisher Scientific | AAA1775922 | US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability. |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA |
| Coelenterazine (native) | Nanolight / Prolume | 3035MG | Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM) |
| OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 6005290 | Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent | BioTek | 8041000 | A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required. |
| 8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL) | Integra | 4724 | An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format |
| 8-channel 200 µL pipette | Transferpette S 20-200 µL | 2703710 |
References
- Kalwat, M. A., et al. Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways. ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).
- Burns, S. M., et al. High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function. Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).
- Rajan, S., et al. In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes. American Journal of Physiology – Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).
- Watkins, S., et al. Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide. Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).
- Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence. Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).
- Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo. Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).
- Burns, S. M., Wagner, B. K., Vetere, A. Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. , (2018).
- Kalwat, M. A., et al. Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells. Journal of General Physiology. , (2018).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15 (1), 14 (2014).
- Ohmiya, Y., Wu, C. Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity. U.S. Patent. , (2010).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).
- Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
- Henquin, J. C. Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose. Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).
- Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification. Molecular & Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).
- Straub, S. G., Sharp, G. W. Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).
- Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868 (2012).
- Head, W. S., et al. Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious. Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).
- Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet. The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129 (2), 359-370 (2007).
- Jaques, F., et al. Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion. Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).
- Calabrese, A., et al. Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells. Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).
- Bielefeld-Sevigny, M. AlphaLISA immunoassay platform- the "no-wash" high-throughput alternative to ELISA. Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).
- Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles. Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835 (2018).
- Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion. Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).
- Frank, J. A., et al. Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release. Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
