공동 분비 된 루시퍼라제 대리를 사용하여 상대 인슐린 분비 측정
Summary
이 프로토콜은 베타 세포에서 인슐린 분비를 위한 프록시로 인슐린 연결된 Gaussia luciferase를 사용하여 중간 처리량에서 급속한 저비용 luciferase 분석기를 능력을 발휘하는 방법을 기술합니다. 이 분석은 대부분의 발광 플레이트 판독기 및 다중 채널 파이펫으로 수행될 수 있습니다.
Abstract
분비된 인슐린 후 샘플 수집을 위한 항체 기반 분석은 일반적으로 분석 시간의 하루에 몇 시간을 필요로 하며, 특정 분석법에 따라 비쌀 수 있다. 분비된 루시페라아제 분석제는 결과를 신속히 하고 샘플당 분석 비용을 실질적으로 낮춥시한다. 여기에서 우리는 C-펩티드 내의 유전으로 삽입된 Gaussia luciferase를 사용하여 췌장 β 세포에서 인슐린 분비 활동을 측정하기 위하여 상대적으로 과소 이용된 접근을 제시합니다. 프로 인슐린의 프로테올리처리 동안, C-펩타이드는 인슐린과 병용비되는 인슐린 분비 소포 내에서 루시페라제를 방출하는 절제된다. 결과는 luciferase assays의 속도 때문에 견본 수집 후에 분 안에 장악될 수 있습니다. 분석의 한계는 인슐린 분비의 상대적인 측정이지 절대 정량이 아니라는 것입니다. 그러나 이 프로토콜은 경제적이고 확장 가능하며 대부분의 표준 발광 플레이트 판독기를 사용하여 수행할 수 있습니다. 아날로그 및 디지털 멀티채널 파이펫은 분석의 여러 단계를 용이하게 합니다. 많은 다른 실험 적 변형을 동시에 테스트 할 수 있습니다. 조건의 집중된 세트가 결정되면, 인슐린 사격량은 luciferase 분석 결과를 확인하기 위하여 표준 곡선을 가진 항체 기지를 둔 분석제를 사용하여 직접 측정되어야 합니다.
Introduction
여기에 제시된 방법은 유전자 변형 베타 세포주에서 인슐린 분비가 96 웰 플레이트 형식으로 신속하고 저렴하게 분석될 수 있게 한다. 이 프로토콜의 핵심은 인슐린-가우시아(InsGLuc) 1,2를생성하기 위해 C-펩티드내로 삽입된 자연분비 가우시아 루시퍼라제(GLuc, ~18 kDa)를 삽입한 인슐린의 변형된 버전이다. GFP (~25 kDa)와 같은 다른 더 큰 단백질은 성공적으로 인슐린의 C-펩티드에 삽입되고 인슐린과 GFP-C-펩타이드3,4에대한 프로인슐린-GFP로부터 예상되는 번역 후 처리를 나타냈다. 본 프로토콜의 분석의 경우, GLuc는 포유류 발현에 최적화된 코돈및 2개의 돌연변이가 도입되어광과 같은 역학을 향상시키고 5,6. 치료 조건의 다중 조합 및 복제는 96 웰 플레이트 형식으로 용이하게 테스트할 수 있으며 실험 직후 분비 결과를 얻을 수 있다.
앞서 언급한 바와같이 2의 주요 장점은 효소 연계 면역흡착 분석(ELISAs)의 상대적으로 높은 비용과 기술적 측면과 차별화되는 이 루시퍼라제 기반 분비 측정(&$0.01/well)의 저렴한 비용입니다. > $2/well) 및 균일한 시간 해결 형광 (HTRF) 또는 다른 Förster 공명 에너지 전송 (FRET) 기반 항체 (> $1/well) 분석. 표준 곡선을 참조하여 인슐린의 농도를 측정하는 이러한 항체 기반 분석과 비교하여 InsGLuc 분석은 플레이트상에서 웰을 제어하는 상대적 비교로 분비 활성을 측정합니다. 이러한 이유로 모든 실험에는 적절한 컨트롤이 포함되어야 합니다. 이러한 구분은 신속하고 저렴한 측정을 허용하는 절충안입니다. 그러나, InsGLuc 분비는 ELISA1,2에의해 측정된 바와 같이 인슐린 분비와 높은 상관관계가 있는 것으로 입증되었다. 이 기술은 고처리량 스크리닝 1,2,7을 위해 확장되었으며 전압 게이트 칼륨 채널 억제제 7을 포함한 인슐린 분비물의 새로운 변조기의 식별을 주도하고 있다7 뿐만 아니라 β 세포 기능의 천연 생성억제제, 크로모마이신 A28. InsGLuc의 사용은 지속적으로 인슐린 분 비에 미치는 영향에 대 한 많은 다른 치료 조건을 테스트 하려는 연구원에 대 한 가장 적합. 후속 실험에서 부모 β 세포주에서 주요 발견을 반복하고, 뮤린 또는 인간 아일에서 최적으로, 항체 기반 분석을 사용하여 인슐린 분비를 측정할 필요가 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 우리는 MIN6 β 세포로부터의 포도당 자극 인슐린 분비 반응을 신속하게 평가하는 방법을 제시한다. 분석에서 최상의 응답을 위해 적절한 밀도로 MIN6 세포를 시드하고 85-95 % 동시성으로 하는 것이 중요합니다. 이는 1차 섬17,18,19,20,21뿐만 아니라 MIN6에서 모두 발생하는 향상된 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 귀중한 일과 토론에 대한 Cobb 실험실의 모든 현재 및 전 회원, 행정 지원을 위한 Dionne Ware에 감사드립니다. 마이클 칼왓은 청소년 당뇨병 연구 재단 SRA-2019-702-Q-R에 의해 지원됩니다. 이 작품은 NIH R37 DK34128과 웰치 재단 보조금 I1243을 통해 멜라니 콥에 가능하게되었다. 이 작업의 초기 부분은 또한 마이클 칼왓에 NIH F32 DK100113에 의해 지원되었다.
Materials
| Cell culture materials | |||
| rIns-GLuc stable MIN6 cells | Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 4.5 g/L glucose media |
| fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| beta-mercaptoethanol | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| glutamine | Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C. |
| T75 tissue culture flasks | Fisher Scientific | 07-202-000 | |
| 96 well tissue culture plates | Celltreat | 229196 | |
| Reagent reservoirs (50 mL) | Corning | 4870 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secretion assay reagents | |||
| BSA (RIA grade) | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific | 15568414 | |
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional drugs for stimulation experiments | |||
| Diazoxide | Sigma | D9035 | Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added. |
| epinephrine (bitartrate salt) | Sigma | E4375 | Stock solution: 5 mM in water |
| PMA (phorbol 12-myristate) | Sigma | P1585 | Stock solution: 100 µM in DMSO |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guassia assay materials | |||
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| Glycerol | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| Sodium Bromide | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | Stock solution: 0.5 M pH 8 |
| Tris base | RPI | T60040-1000.0 | Stock solution: 1 M pH 8 |
| Ascorbic Acid | Fisher Scientific | AAA1775922 | US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability. |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA |
| Coelenterazine (native) | Nanolight / Prolume | 3035MG | Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM) |
| OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 6005290 | Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent | BioTek | 8041000 | A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required. |
| 8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL) | Integra | 4724 | An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format |
| 8-channel 200 µL pipette | Transferpette S 20-200 µL | 2703710 |
References
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