מדידת הפרשת אינסולין יחסית באמצעות מחליף שכונתיות לוציפראז
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע מהירה בעלות נמוכה לוציפרראז בחני בתפוקה בינונית באמצעות העברת אינסולין מקושרת של גאוסיה לוציפראז כפרוקסי עבור הפרשת אינסולין מתאי בטא. ניתן לבצע את האפשרות עם מרבית קוראי הצלחות והפיפטות רב ערוצית.
Abstract
ביצוע נוגדנים מבוססי נוגדן עבור אוסף המופרש לאחר הדגימה לאחר מכן דורש בדרך כלל כמה שעות עד יום של זמן הצורך והוא יכול להיות יקר, בהתאם לצורך הספציפי. לוציפראז מופרש מזרז את התוצאות ולהקטין את עלות הכדאיות לכל מדגם באופן משמעותי. כאן אנו מציגים גישה בשימוש מועט יחסית כדי לאמוד פעילות הפרשה אינסולין מתאי β הלבלב באמצעות Gaussia לוציפראז מוכנס גנטית בתוך C-פפטיד. במהלך העיבוד האנטי-נגד-חרדה של הפרואינסולין, הג-פפטיד משחרר את הלוציפראז בתוך הפרשת האינסולין ושלפוחית האנרגיה שבה הוא מופרש עם אינסולין. תוצאות ניתן לקבל בתוך דקות לאחר איסוף המדגם בגלל המהירות של לוציפראאז assays. הגבלה של התשובה היא שזהו מדידה יחסית של הפרשת אינסולין ולא כימות מוחלטת. עם זאת, פרוטוקול זה הוא חסכוני, מדרגי, וניתן לבצע באמצעות מרבית קוראי לוחיות האור הרגילות. פיפטות אנלוגי ודיגיטלי רב ערוצי להקל על מספר שלבים של השיטת. ניתן לבדוק במקביל וריאציות נסיוניות רבות. לאחר מערכת ממוקדת של תנאים הם החליטו על, ריכוזי אינסולין צריך להיות נמדד ישירות באמצעות נוגדן מבוסס בחני עם עקומות סטנדרטיות כדי לאשר את תוצאות שיטת ללוציפראז.
Introduction
השיטה המוצגת כאן מאפשרת הפרשת אינסולין מקו בטא שונה גנטית להיות מוכן במהירות ובאופן בלתי נשכח בפורמט 96-היטב-צלחת. המפתח לפרוטוקול זה הוא גרסה משתנה של אינסולין עם הגאוסיה המופרש באופן טבעי (gluc, ~ 18 kda) הוכנס ( ראה איור 1) לתוך ה-C פפטיד כדי ליצור אינסולין-גאוסייה (insgluc)1,2. חלבונים גדולים אחרים, כגון gfp (~ 25 kda), הוכנסו בהצלחה לתוך C-פפטיד של אינסולין והציגו את העיבוד לאחר הניתוח הצפוי מתוך proinsulin-gfp לאינסולין ו gfp-C-פפטיד3,4. עבור הצורך בפרוטוקול זה, gluc כבר ממוטב codon עבור ביטוי היונקים ושני מוטציות הוצגו כדי לשפר זוהר כמו הקינטיקה5,6. ניתן לבדוק בקלות צירופים מרובים ושכפול של תנאי טיפול בתבנית 96-היטב, וניתן לקבל את תוצאות ההפרשה מיד לאחר הניסוי.
יתרון מרכזי, כפי שצוין בעבר2, הוא העלות הנמוכה של מדידה זו הפרשה מבוסס לluciferase ( $2/ובכן) ו-פלואורסצנטית הומוגנית בזמן (HTRF) או אחרים Förster העברת אנרגיה (מבוסס) נוגדן (> $1/ובכן) assays. בהשוואה לאלה המבוססים על נוגדנים, אשר למדוד את הריכוז של האינסולין על ידי התייחסות עיקול סטנדרטי, שיטת InsGLuc מודד פעילות הפרשה כהשוואה יחסית לשלוט בארות על הצלחת. מסיבה זו, כל ניסוי דורש הכללה של שליטה נאותה. הבחנה זו היא עסקת חליפין כדי לאפשר מדידות מהירות וזולה. עם זאת, הפרשת insgluc הוכח להיות מתואם מאוד עם הפרשת אינסולין כפי שנמדד על ידי אליסה1,2. טכנולוגיה זו הפכה להיות מדורגים עבור הקרנת תפוקה גבוהה1,2,7 והובילה לזיהוי של מודולים הרומן של הפרשת אינסולין כולל מעכבי מגודרת מתח תעלת אשלגן7 כמו גם מעכב מוצר טבעי של β cell פונקציה, Chromomycin a28. השימוש ב-InsGLuc הוא המתאים ביותר עבור חוקרים המתכננים לבחון ללא הרף תנאי טיפול שונים להשפעה שלהם על הפרשת אינסולין. בניסויים מעקב יש צורך לחזור על ממצאים מרכזיים בתוך קו β הורים, ובצורה אופטימלית באיים מוריים או בני אדם, ולמדוד הפרשת אינסולין באמצעות שיטת נוגדן מבוססת.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מציגים שיטה להעריך במהירות גלוקוז מגורה הפרשות אינסולין תגובות מתאי MIN6 β. לקבלת התגובות הטובות ביותר בסדר זה חשוב לזרוע את התאים MIN6 בצפיפות הנכונה ולאפשר להם להפוך 85-95% confluent. זה משפר את התגובות β cell לגלוקוז בגלל שיפור תא הקשר וסינכרון התאים, אשר מתרחשת הן באיים הראשיים17</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לכל החברים הנוכחיים והקודמים במעבדת קוב לעבודה ולדיונים יקרי ערך, ולדיון וואר לסיוע מינהלי. מיכאל קאלוואט נתמך על ידי קרן המחקר לסוכרת קטינים סרה-2019-702-Q-R. עבודה זו נעשתה אפשרית דרך NIH R37 DK34128 ו וולש קרן גרנט I1243 למלאני קוב. חלקים מוקדמים של עבודה זו היו נתמכים גם על ידי NIH F32 DK100113 למייקל קאלוואט.
Materials
| Cell culture materials | |||
| rIns-GLuc stable MIN6 cells | Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 4.5 g/L glucose media |
| fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| beta-mercaptoethanol | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| glutamine | Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C. |
| T75 tissue culture flasks | Fisher Scientific | 07-202-000 | |
| 96 well tissue culture plates | Celltreat | 229196 | |
| Reagent reservoirs (50 mL) | Corning | 4870 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secretion assay reagents | |||
| BSA (RIA grade) | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific | 15568414 | |
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional drugs for stimulation experiments | |||
| Diazoxide | Sigma | D9035 | Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added. |
| epinephrine (bitartrate salt) | Sigma | E4375 | Stock solution: 5 mM in water |
| PMA (phorbol 12-myristate) | Sigma | P1585 | Stock solution: 100 µM in DMSO |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guassia assay materials | |||
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| Glycerol | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| Sodium Bromide | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | Stock solution: 0.5 M pH 8 |
| Tris base | RPI | T60040-1000.0 | Stock solution: 1 M pH 8 |
| Ascorbic Acid | Fisher Scientific | AAA1775922 | US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability. |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA |
| Coelenterazine (native) | Nanolight / Prolume | 3035MG | Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM) |
| OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 6005290 | Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent | BioTek | 8041000 | A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required. |
| 8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL) | Integra | 4724 | An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format |
| 8-channel 200 µL pipette | Transferpette S 20-200 µL | 2703710 |
References
- Kalwat, M. A., et al. Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways. ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).
- Burns, S. M., et al. High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function. Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).
- Rajan, S., et al. In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes. American Journal of Physiology – Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).
- Watkins, S., et al. Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide. Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).
- Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence. Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).
- Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo. Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).
- Burns, S. M., Wagner, B. K., Vetere, A. Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. , (2018).
- Kalwat, M. A., et al. Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells. Journal of General Physiology. , (2018).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15 (1), 14 (2014).
- Ohmiya, Y., Wu, C. Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity. U.S. Patent. , (2010).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).
- Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
- Henquin, J. C. Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose. Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).
- Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification. Molecular & Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).
- Straub, S. G., Sharp, G. W. Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).
- Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868 (2012).
- Head, W. S., et al. Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious. Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).
- Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet. The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129 (2), 359-370 (2007).
- Jaques, F., et al. Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion. Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).
- Calabrese, A., et al. Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells. Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).
- Bielefeld-Sevigny, M. AlphaLISA immunoassay platform- the "no-wash" high-throughput alternative to ELISA. Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).
- Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles. Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835 (2018).
- Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion. Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).
- Frank, J. A., et al. Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release. Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
