共分泌ルシフェラーゼサロゲートを用いた相対インスリン分泌の測定
Summary
このプロトコルは、β細胞からのインスリン分泌のプロキシとしてインスリン連結ガウシアルシフェラーゼを使用して中程度のスループットで迅速な低コストルシフェラーゼアッセイを行う方法について説明する。アッセイは、ほとんどの発光プレートリーダーおよびマルチチャンネルピペットで行うことができる。
Abstract
分泌されたインスリンサンプルコレクションに対する抗体ベースのアッセイを行うには、通常、アッセイ時間の1日に数時間を要し、特定のアッセイに応じて高価になる可能性があります。分泌されたルシフェラーゼアッセイは、結果を促進し、サンプルあたりのアッセイコストを大幅に下げる。ここでは、C-ペプチド内に遺伝的に挿入されたガウシア・ルシフェラーゼを用いて膵β細胞からのインスリン分泌活性を測定する比較的使用されていないアプローチを提示する。プロインスリンのタンパク化処理中に、C-ペプチドは、インスリンと共分泌されるインスリン分泌性小胞内のルシフェラーゼを放出して取り除く。結果はルシフェラーゼアッセイの速度のためにサンプル収集後数分以内に得ることができる。アッセイの限界は、インスリン分泌の相対測定であり、絶対定量ではないことです。しかし、このプロトコルは経済的でスケーラブルであり、ほとんどの標準的な発光板リーダーを使用して実行することができます。アナログおよびデジタルマルチチャンネルピペットは、アッセイの複数のステップを容易にします。多くの異なる実験バリエーションを同時にテストすることができます。焦点を絞った条件が決定されたら、標準曲線を用いた抗体ベースのアッセイを使用してインスリン濃度を直接測定し、ルシフェラーゼアッセイ結果を確認する必要があります。
Introduction
ここで提示される方法は、遺伝子組み換えβ細胞株からのインスリン分泌を96ウェルプレート形式で迅速かつ手頃な価格でアッセイすることを可能にする。このプロトコルの鍵は、自然に分泌されたガウシア・ルシフェラーゼ(GLuc,~18 kDa)をCペプチドに挿入してインスリン・ガウシア(InsGLuc)1、2を生成するインスリンの改変バージョンである(図1参照)。GFP(〜25kDa)のような他のより大きなタンパク質は、インスリンのC-ペプチドに正常に挿入され、プロインスリン-GFPからインスリンおよびGFP-C-ペプチド3、4への予想される翻訳後処理を示した。このプロトコルのアッセイでは、GLucは哺乳類発現に対してコドン最適化されており、2つの変異が輝きのような運動学5、6を増強するために導入されている。治療条件の複数の組み合わせおよび複製は96ウェルプレート形式で容易にテストすることができ、分泌結果は実験の直後に得ることができる。
前述の2として、主な利点は、このルシフェラーゼベースの分泌測定( $2/well) および均質な時間分解蛍光 (HTRF) またはその他のフェルスター共鳴エネルギー伝達 (FRET) ベースの抗体 (> $1/well) アッセイ.標準曲線を参照してインスリンの濃度を測定するこれらの抗体ベースのアッセイと比較して、InsGLucアッセイは、プレート上のウェルを制御するための相対的な比較として分泌活性を測定します。そのため、すべての実験には適切なコントロールが必要です。この区別は、迅速かつ安価な測定を可能にするトレードオフです。しかしながら、InsGLuc分泌は、ELISA1,2によって測定されたインスリン分泌と高度に相関することが実証されている。この技術は、ハイスループットスクリーニング1、2、7のためにスケールアップされ、電圧ゲートカリウムチャネル阻害剤7を含むインスリン分泌の新規モジュレーターの同定につながっています7β細胞機能の天然物阻害剤と同様に、染色体A28.InsGLuc の使用は、インスリン分泌への影響について多くの異なる治療条件を継続的にテストする予定の研究者に最も適しています。フォローアップ実験では、親のβ細胞株で重要な知見を繰り返し、マウスやヒトの島で最適に、抗体ベースのアッセイを用いてインスリン分泌を測定する必要があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細損では、MIN6β細胞からのグルコース刺激インスリン分泌応答を迅速に評価する方法を提示する。アッセイで最良の応答を得るためには、MIN6細胞を適切な密度で播種し、それらが85-95%のコンフルエントになることを可能にすることが重要です。これは、一次島17、18、19、20、21およびMIN6の両方で起<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、貴重な仕事と議論のためにコブ研究所のすべての現在および元メンバーに感謝し、行政支援のためのディオンヌウェア。マイケル・カルワットは、若年性糖尿病研究財団SRA-2019-702-Q-Rによってサポートされています。この作業は、NIH R37 DK34128とウェルチ財団グラントI1243を通じてメラニー・コブに可能になりました。この作業の初期の部分は、マイケル・カルワットにNIH F32 DK100113によってもサポートされました。
Materials
| Cell culture materials | |||
| rIns-GLuc stable MIN6 cells | Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 4.5 g/L glucose media |
| fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| beta-mercaptoethanol | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| glutamine | Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C. |
| T75 tissue culture flasks | Fisher Scientific | 07-202-000 | |
| 96 well tissue culture plates | Celltreat | 229196 | |
| Reagent reservoirs (50 mL) | Corning | 4870 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secretion assay reagents | |||
| BSA (RIA grade) | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific | 15568414 | |
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional drugs for stimulation experiments | |||
| Diazoxide | Sigma | D9035 | Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added. |
| epinephrine (bitartrate salt) | Sigma | E4375 | Stock solution: 5 mM in water |
| PMA (phorbol 12-myristate) | Sigma | P1585 | Stock solution: 100 µM in DMSO |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guassia assay materials | |||
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| Glycerol | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| Sodium Bromide | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | Stock solution: 0.5 M pH 8 |
| Tris base | RPI | T60040-1000.0 | Stock solution: 1 M pH 8 |
| Ascorbic Acid | Fisher Scientific | AAA1775922 | US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability. |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA |
| Coelenterazine (native) | Nanolight / Prolume | 3035MG | Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM) |
| OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 6005290 | Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent | BioTek | 8041000 | A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required. |
| 8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL) | Integra | 4724 | An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format |
| 8-channel 200 µL pipette | Transferpette S 20-200 µL | 2703710 |
References
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