Meten van relatieve insuline secretie met behulp van een co-afgescheiden Luciferase surrogaat
Summary
In dit protocol wordt beschreven hoe u snelle Low-cost Luciferase-analyses uitvoeren bij medium-throughput met behulp van een insuline-linked Gaussia Luciferase als proxy voor insuline secretie van beta-cellen. De assay kan uitgevoerd worden met de meeste luminescentie plaat lezers en multichannel pipetten.
Abstract
Het uitvoeren van antilichaam-gebaseerde analyses voor afgescheiden insuline post-sample collectie vereist meestal een paar uur tot een dag van de assay tijd en kan duur zijn, afhankelijk van de specifieke assay. De afgescheiden Luciferase analyses versnellen resultaten en verminderen wezenlijk de analyse kosten per steekproef. Hier presenteren we een relatief onderbenut benadering van insuline secretoire activiteit van de pancreas β cellen meten met behulp van Gaussia Luciferase genetisch ingevoegd binnen de C-peptide. Tijdens Proteolytische verwerking van proinsuline, het C-peptide is het vrijgeven van de Luciferase binnen de insuline secretoire blaasje waar het wordt co-afgescheiden met insuline. De resultaten kunnen binnen minuten na steekproef inzameling wegens de snelheid van Luciferase analyses worden verkregen. Een beperking van de assay is dat het een relatieve meting van de insuline secretie en niet een absolute kwantificatie. Echter, dit protocol is zuinig, schaalbaar, en kan worden uitgevoerd met behulp van de meeste standaard luminescentie plaat lezers. Analoge en digitale MultiChannel pipetten vergemakkelijken meerdere stappen van de assay. Veel verschillende experimentele variaties kunnen gelijktijdig worden getest. Zodra een geconcentreerde reeks voorwaarden wordt beslist op, zouden de insuline concentraties direct moeten worden gemeten gebruikend op antilichaam-gebaseerde analyses met standaard krommen om de Luciferase testresultaten te bevestigen.
Introduction
De hier gepresenteerde methode maakt insuline secretie van een genetisch gemodificeerde Beta Cell line te worden getest snel en betaalbaar in 96-well-plate formaat. De sleutel tot dit protocol is een gewijzigde versie van insuline met de natuurlijk-afgescheiden Gaussia Luciferase (GLuc, ~ 18 kDa) ingevoegd ( Zie figuur 1) in het C-peptide te genereren insuline-Gaussia (InsGLuc)1,2. Andere grotere proteïnen, zoals GFP (~ 25 kDa), zijn met succes opgenomen in C-peptide van insuline en tentoongesteld de verwachte post-translationele verwerking van proinsuline-GFP aan insuline en GFP-C-peptide3,4. Voor de bepaling in dit protocol, GLuc is codon-geoptimaliseerd voor zoogdier expressie en twee mutaties zijn ingevoerd om te verbeteren Glow-like kinetica5,6. Meerdere combinaties en replicatie van de behandeling voorwaarden kunnen gemakkelijk worden getest in 96-goed-plaat formaat en de secretie resultaten kunnen onmiddellijk na het experiment worden verkregen.
Een groot voordeel, zoals eerder opgemerkt2, is de lage kosten van deze Luciferase-based secretie meting ( $2/well) en homogene tijd-opgeloste fluorescentie (HTRF) of andere Förster resonantie energieoverdracht (FRET)-gebaseerd antilichaam (> $1/well) assays. In vergelijking met deze antilichaam-gebaseerde analyses, die de concentratie van insuline meten door naar een standaardkromme te verwijzen, meet de InsGLuc analyse secretoire activiteit als relatieve vergelijking aan controleputten op de plaat. Om die reden, elk experiment vereist de opneming van de juiste controles. Dit onderscheid is een trade-off om snelle en goedkope metingen mogelijk te maken. Echter, InsGLuc secretie is aangetoond dat sterk gecorreleerd met insuline secretie zoals gemeten door Elisa1,2. Deze technologie is opgeschaald voor high-throughput screening1,2,7 en heeft geleid tot de identificatie van nieuwe modulatoren van insuline secretie met inbegrip van een voltage-gated kaliumkanaal remmer7 evenals een natuurlijke product Inhibitor van β cel functie, Chromomycin a28. Het gebruik van InsGLuc is het meest geschikt voor onderzoekers die van plan zijn om voortdurend te testen veel verschillende behandelingsvoorwaarden voor hun impact op insuline secretie. In vervolgexperimenten is het noodzakelijk om zeer belangrijke bevindingen in een ouderlijke β cel lijn, en optimaal in muizen of menselijke eilandjes te herhalen, en insulineafscheiding te meten gebruikend een op antilichaam-gebaseerde analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierin presenteren we een methode om snel te beoordelen glucose-gestimuleerd insuline secretie reacties van MIN6 β cellen. Voor de beste reacties in de assay is het belangrijk om de MIN6 cellen zaad op de juiste dichtheid en hen in staat stellen te worden 85-95% Confluent. Dit verbetert β cel reacties op glucose wegens betere cel-cel contacten en synchronisatie, die zowel in primaire eilandjes17, 18,19,<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken alle huidige en voormalige leden van het Cobb Laboratory voor waardevolle werk en discussies, en Dionne ware voor administratieve bijstand. Michael Kalwat wordt ondersteund door een juveniele diabetes Research Foundation SRA-2019-702-Q-R. Dit werk werd mogelijk gemaakt door NIH R37 DK34128 en Welch Foundation Grant I1243 aan Melanie Cobb. De vroege delen van dit werk werden ook gesteund door een NIH F32 DK100113 aan Michael Kalwat.
Materials
| Cell culture materials | |||
| rIns-GLuc stable MIN6 cells | Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 4.5 g/L glucose media |
| fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| beta-mercaptoethanol | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| glutamine | Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C. |
| T75 tissue culture flasks | Fisher Scientific | 07-202-000 | |
| 96 well tissue culture plates | Celltreat | 229196 | |
| Reagent reservoirs (50 mL) | Corning | 4870 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secretion assay reagents | |||
| BSA (RIA grade) | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific | 15568414 | |
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional drugs for stimulation experiments | |||
| Diazoxide | Sigma | D9035 | Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added. |
| epinephrine (bitartrate salt) | Sigma | E4375 | Stock solution: 5 mM in water |
| PMA (phorbol 12-myristate) | Sigma | P1585 | Stock solution: 100 µM in DMSO |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guassia assay materials | |||
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| Glycerol | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| Sodium Bromide | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | Stock solution: 0.5 M pH 8 |
| Tris base | RPI | T60040-1000.0 | Stock solution: 1 M pH 8 |
| Ascorbic Acid | Fisher Scientific | AAA1775922 | US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability. |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA |
| Coelenterazine (native) | Nanolight / Prolume | 3035MG | Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM) |
| OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 6005290 | Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent | BioTek | 8041000 | A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required. |
| 8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL) | Integra | 4724 | An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format |
| 8-channel 200 µL pipette | Transferpette S 20-200 µL | 2703710 |
References
- Kalwat, M. A., et al. Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways. ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).
- Burns, S. M., et al. High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function. Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).
- Rajan, S., et al. In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes. American Journal of Physiology – Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).
- Watkins, S., et al. Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide. Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).
- Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence. Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).
- Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo. Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).
- Burns, S. M., Wagner, B. K., Vetere, A. Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. , (2018).
- Kalwat, M. A., et al. Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells. Journal of General Physiology. , (2018).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15 (1), 14 (2014).
- Ohmiya, Y., Wu, C. Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity. U.S. Patent. , (2010).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).
- Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
- Henquin, J. C. Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose. Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).
- Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification. Molecular & Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).
- Straub, S. G., Sharp, G. W. Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).
- Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868 (2012).
- Head, W. S., et al. Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious. Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).
- Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet. The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129 (2), 359-370 (2007).
- Jaques, F., et al. Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion. Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).
- Calabrese, A., et al. Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells. Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).
- Bielefeld-Sevigny, M. AlphaLISA immunoassay platform- the "no-wash" high-throughput alternative to ELISA. Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).
- Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles. Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835 (2018).
- Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion. Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).
- Frank, J. A., et al. Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release. Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
