采用亲水相互作用色谱超高效液相色谱法（UPLC）对免疫球蛋白G（IgG）N-糖链进行表征。此外，IgG N-糖链的结构可被清晰分离。本文介绍了该实验方法，以促进其在科研领域的广泛应用。
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本文内容
摘要
摘要
糖组学是组学系统研究中的一个新兴亚专业领域，在发现下一代疾病易感性生物标志物、药物靶点以及精准医学方面具有重要意义。已有研究报道，在多种常见慢性疾病中存在IgG N-聚糖的变异形式，并提示其在临床应用中具有巨大潜力（例如作为疾病诊断和预测的生物标志物）。目前广泛采用亲水相互作用色谱法结合超高效液相色谱（HILIC UPLC）对IgG N-聚糖进行表征。UPLC是一种稳定性好、重复性高且相对定量准确性高的检测技术。此外，该方法可实现IgG N-聚糖结构的清晰分离，从而准确鉴定血浆中聚糖的组成及其相对丰度。
引言
N-糖基化是人类蛋白质中常见且必需的一种翻译后修饰1，有助于相对准确地预测疾病的发生与发展。由于其结构复杂，预计存在超过5,000种糖链结构，因而作为疾病诊断和预测的生物标志物具有巨大潜力2。免疫球蛋白G（IgG）上的N-糖链已被证实对IgG的功能至关重要，且IgG的N-糖基化参与调控促炎与抗炎系统之间的平衡3。IgG N-糖基化的差异参与了疾病的发生和发展过程，既反映了疾病的易感性，也体现了疾病病理中的功能机制。IgG N-糖基化的炎症作用已与衰老、炎症性疾病、自身免疫性疾病以及癌症相关联4。
随着检测技术的发展，以下方法在高通量糖组学研究中得到了广泛应用：亲水相互作用色谱-超高效液相色谱荧光检测法（HILIC-UPLC-FLR）、多重毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光检测法（xCGE-LIF）、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF-MS）以及液相色谱-电喷雾质谱法（LC-ESI-MS）。这些方法克服了以往通量低、结果不稳定以及灵敏度和特异性差等缺点5,6。
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方案
本研究方案中所有受试者均经中国北京首都医科大学伦理委员会批准12。在研究开始前，已从每位受试者处获得书面知情同意书。
1. IgG 分离
- 准备试剂，包括结合缓冲液（磷酸盐缓冲液，PBS）：1× PBS（pH = 7.4），中和缓冲液：10× PBS（pH = 6.6–6.8），洗脱液：0.1 M 甲酸（pH = 2.5），洗脱液中和溶液：1 M 碳酸氢铵，保存缓冲液：20% 乙醇 + 20 mM Tris + 0.1 M NaCl（pH = 7.4），蛋白G清洗液：0.1 M NaOH + 30% 异丙醇。
注意：本方案中pH值至关重要。IgG的洗脱需要极低的pH，但存在因酸水解导致唾液酸丢失的风险。因此，洗脱过程需在数秒内完成，并迅速将pH恢复至中性，以保持IgG及唾液酸的完整性。 - 准备样品：将冷冻血浆样品解冻后，在80 × g 条件下离心10分钟，并将蛋白G整体柱板及上述试剂在室温（RT）下平衡30分钟。
- 取100 µL样品（可使用2倍量以防止首次操作失败）加入2 mL收集板中（本实验设计共96孔板，包含6个标准样品、1个对照样品[超纯水]和89个血浆样品，并随机分配至板中）。
- 用1× PBS按1:7（v/v）稀释样品。
- 用200 µL超纯水清洗0.45 µm亲水性聚丙烯（GHP）滤板（重复....
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结果
如图1所示，根据峰位置和保留时间，IgG N-糖链被分析为24个初始IgG糖链峰（GPs）。通过质谱检测可确定这些N-糖链的结构，具体结构信息见先前研究（表1）15。为确保结果具有可比性，采用了总面积归一化方法，即每个峰中糖链的含量以总积分面积的百分比表示。
为评估该方法的重复性和稳定性，对标准样品进行了六次平行测定。如表2所示，24种糖基化位点（GP）的变异系数（CV）介于1.84%–16.73%之间，其中15个（62.50%）低于10%。比例相对较小的GP（≤1.16%）表现出较高的测量误差（CV超过10%）。此外，来自76名个体的IgG N-糖链谱图整合结果（图2
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讨论
UPLC 是一种相对定量分析方法5,15。结果表明，UPLC 是一种稳定性好、重复性高且具有较好相对定量准确性的检测技术。各峰中糖链的含量以 UPLC 测得的总积分面积百分比表示，该值为相对值。相对定量提高了待测样本之间的可比性。此外，采用 96 孔蛋白 G 板可一次性纯化 96 个样本的 IgG，实现高通量检测。根据既往研究，蛋白 G 结合 IgG 的能力强于蛋白 A15,16。
此外，IgG N-糖链的结构被明确区分开来。衍生的IgG糖链用于描述半乳糖基化、唾液酸化、双分枝GlcNAc以及核心岩藻糖基化的水平，这些指标通过初始的IgG N-糖链计算得出。在之前的研究中，某些衍生糖链（FBn、FBG0n / G0n、FBn /.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了中国国家自然科学基金（81673247 ＆ 81872682）和澳中合作研究基金（NH ＆ MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-氨基苯甲酰胺，2-AB | Sigma, 中国 | ||
| 96孔收集板 | AXYGEN | ||
| 96孔滤膜板 | Pol | 0.45 um GHP | |
| 96孔整体柱板 | BIA Separations | ||
| 96孔板转子 | Eppendorf Co., Ltd, 德国 | T_1087461900 | |
| 乙酸 | Sigma, 中国 | ||
| 乙腈 | 汇海科仪科技有限公司, 中国 | ||
| 碳酸氢铵 | 生工生物工程有限公司, 中国 | ||
| 甲酸铵 | 北京民瑞达科技有限公司 | ||
| 恒温振荡培养箱/摇床 | 智城分析仪器制造有限公司, 中国 | ZWY-10313 | |
| 葡聚糖校准梯度/糖肽柱 | 沃特世科技有限公司, 中国 | BEH柱 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma, 中国 | ||
| 磷酸氢二钠 | 生工生物工程有限公司, 中国 | ||
| 电热鼓风干燥箱 | 特思达仪器有限公司 | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | 沃特世科技有限公司, 美国 | ||
| 乙醇 | 汇海科仪科技有限公司, 中国 | ||
| 甲酸 | Sigma, 中国 | ||
| GlycoProfile 2-AB 标记试剂盒 | Sigma, 中国 | ||
| HCl | 君瑞生物科技有限公司, 中国 | ||
| 高速离心机 | Eppendorf Co., Ltd, 德国 | 5430 | |
| Igepal | Sigma, 中国 | ||
| 低温离心机 | Eppendorf Co., Ltd, 德国 | ||
| 低温冰箱 | 青岛海尔有限公司 | ||
| 96孔板真空 manifold 装置 | 沃特世科技有限公司, 中国 | 186001831 | |
| 甲醇 | 汇海科仪科技有限公司, 中国 | ||
| Milli-Q 超纯水仪 | 默克密理博有限公司, 美国 | Advantage A10 | |
| NaOH | 生工生物工程有限公司, 中国 | ||
| pH 测试仪 | 赛多利斯有限公司, 德国 | PB-10 | |
| 磷酸盐缓冲液，PBS | 生工生物工程有限公司, 中国 | ||
| 移液器 | Eppendorf Co., Ltd, 德国 | 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl | |
| PNGase F 酶 | Sigma, 中国 | ||
| 磷酸二氢钾 | 生工生物工程有限公司, 中国 | ||
| 异丙醇 | 汇海科仪科技有限公司, 中国 | ||
| SDS | Sigma, 中国 | ||
| 氯化钠 | 生工生物工程有限公司, 中国 | ||
| 氰基硼氢化钠（NaBH3CN） | Sigma, 中国 | ||
| 分光光度计 | 上海元析仪器有限公司 | B-500 | |
| 多道移液器 | 斯莫菲尔科学科技有限公司, 中国 | 4672100 | |
| Tris | Amresco, 美国 | ||
| 超低温冰箱 | 赛默飞世尔科技有限公司, 美国 | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| 超高效液相色谱仪 | 沃特世科技有限公司, 中国 | Acquity MLtraPerformance LC | |
| 真空泵 | 沃特世科技有限公司, 中国 | 725000604 | |
| 浓缩仪/干燥仪 | Eppendorf Co., Ltd, 德国 | T_1087461900 | |
| 涡旋振荡器 | 常州恩培仪器有限公司, 中国 | NP-30S | |
| 水浴锅 | 特思达仪器有限公司 | DK-98-IIA | |
| 电子天平 | 上海精科天平仪器有限公司 | MP200B |
参考文献
- Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214(2012).
- Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21 (1), (2014).
- Shade, K. T.....
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重印与许可
