Immunoglobuline G N-Glycan-analyse door Ultra-prestatie vloeistofchromatografie
Summary
Immunoglobuline G (IgG) N-glycan wordt gekenmerkt met behulp van hydrofiele interactie CHROMATOGRAFIE UPLC. Daarnaast is de structuur van IgG N-glycan duidelijk gescheiden. Hier gepresenteerd is een inleiding tot deze experimentele methode, zodat het op grote schaal kan worden gebruikt in onderzoeksinstellingen.
Abstract
Glycomics is een nieuwe subspecialiteit in het omics-systeem onderzoek dat een significant potentieel biedt bij het ontdekken van de volgende generatie biomarkers voor ziekte gevoeligheid, detectie van drugs doel en precisie geneeskunde. Alternatieve IgG N-glycans zijn gemeld bij verschillende gemeenschappelijke chronische ziekten en suggereerden veel potentieel in klinische toepassingen (d.w.z. biomarkers voor diagnose en voorspelling van ziekten). IgG N-glycans worden op grote schaal gekenmerkt door de methode van hydrofiele interactie chromatografie (HILIC) Ultra-Performance vloeistofchromatografie (UPLC). UPLC is een stabiele detectietechnologie met een goede reproduceerbaarheid en een hoge relatieve kwantitatieve nauwkeurigheid. Bovendien, de structuur van IgG N-ontwikkelen is duidelijk gescheiden, en ontwikkelen samenstelling en relatieve overvloed in plasma worden gekenmerkt.
Introduction
N-glycosylatie van menselijke eiwitten is een gemeenschappelijke en essentiële post-translationele modificatie1 en kan het optreden en de ontwikkeling van ziekten relatief nauwkeurig voorspellen. Vanwege de complexiteit van de structuur, wordt verwacht dat er meer dan 5.000 ontwikkelen structuren, het bieden van grote potentie als diagnostische en voorspellende biomarkers voor ziekten2. N-glycans gekoppeld aan immunoglobuline G (IgG) zijn essentieel gebleken voor de functie van IgG, en IgG N-glycosylatie neemt deel aan de balans tussen de Pro-en ontstekingsremmende systemen3. Differentiële IgG N-glycosylatie is betrokken bij ziekte ontwikkeling en progressie, die zowel een aanleg als een functioneel mechanisme dat betrokken is bij ziekte pathologie representeren. De ontstekings functie van IgG N-glycosylation is geassocieerd met veroudering, ontstekingsziekten, auto-immuunziekten, en kanker4.
Met de ontwikkeling van detectietechnologie worden de volgende methoden het meest gebruikt in hoge doorvoer glycomics: hydrofiele interactie chromatografie (HILIC) Ultra-Performance vloeistofchromatografie met fluorescentiedetectie (UPLC-FLR), multiplex capillaire gel elektroforese met laser geïnduceerde fluorescentiedetectie (xCGE-LIF), matrix-geassisteerde Laser desorptie/ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF-MS), en vloeibare chromatografie elektro spray massaspectrometrie (LC-ESI-MS) . Deze methoden hebben overwonnen eerdere tekortkomingen van lage flux, instabiele resultaten, en slechte gevoeligheid specificiteit5,6.
UPLC wordt veel gebruikt om de associatie te onderzoeken tussen IgG N-glycosylatie en bepaalde ziekten (d.w.z. veroudering7, obesitas8, dyslipidemie9, type II diabetes10, hypertensie11, ischemische beroerte12, en de ziekte van Parkinson13). In vergelijking met de andere drie bovengenoemde methoden heeft UPLC de volgende voordelen5,14. Ten eerste biedt het een relatieve kwantitatieve analysemethode en de gegevensanalyse die de totale gebieds normalisatie omvat, verbetert de vergelijkbaarheid van elk monster. Ten tweede zijn de kosten van apparatuur en vereiste expertise relatief laag, wat het gemakkelijker maakt om glycosylatie biomarkers in klinische toepassingen te implementeren en te transformeren. Hier gepresenteerd is een inleiding tot UPLC, zodat het meer op grote schaal kan worden gebruikt.
Protocol
Representative Results
Discussion
UPLC dient als relatieve kwantitatieve analysemethode5,15. De resultaten geven aan dat UPLC een stabiele detectietechnologie is met een goede reproduceerbaarheid en relatieve kwantitatieve nauwkeurigheid. De hoeveelheid glycanen in elke piek wordt uitgedrukt als een percentage van het totale geïntegreerde gebied met behulp van UPLC, wat de relatieve waarde is. De relatieve kwantificering verbetert de vergelijkbaarheid van de test monsters. Daarnaast worden 96 we…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) en de Australische-Chinese samenwerkings beurs (NH & MRC-APP1112767-NSFC 81561128020).
Materials
| 2-aminobenzamide, 2-AB | Sigma, China | ||
| 96-well collection plate | AXYGEN | ||
| 96-well filter plate | Pol | 0.45 um GHP | |
| 96-well monolithic plate | BIA Separations | ||
| 96-well plate rotor | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Acetic acid | Sigma, China | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Ammonium bicarbonate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Ammonium formate | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Constant shaking incubator/rocker | Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China | ZWY-10313 | |
| Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column | Watts technology Co., Ltd, China | BEH column | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma, China | ||
| Disodium phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Electric ovens | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Formic acid | Sigma, China | ||
| GlycoProfile 2-AB Labeling kit | Sigma, China | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, China | ||
| High-speed centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 5430 | |
| Igepal | Sigma, China | ||
| Low temperature centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | ||
| Low temperature refrigerator | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Manifold 96-well plate | Watts technology Co., Ltd, China | 186001831 | |
| Methanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Milli-Q pure water meter | Millipore Co., Ltd, America | Advantage A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| PH tester | Sartorius Co., Ltd, Germany | PB-10 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Pipette | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl | |
| PNGase F enzyme | Sigma, China | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Propan-2-ol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| SDS | Sigma, China | ||
| Sodium chloride | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma, China | ||
| Spectrophotometer | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Transfer liquid gun | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China | 4672100 | |
| Tris | Amresco, America | ||
| Ultra-low temperature refrigerator | Thermo Co., Ltd, America | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| Ultra-performance liquid chromatography | Watts technology Co., Ltd, China | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Vacuum Pump | Watts technology Co., Ltd, China | 725000604 | |
| Volatilizing machine/Dryer | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China | NP-30S | |
| Water-bath | Tester instruments Co., Ltd | DK-98-IIA | |
| Weighing balance | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | MP200B |
References
- Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).
- Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21 (1), (2014).
- Shade, K. T. C., Anthony, R. M. Antibody Glycosylation and Inflammation. Antibodies. 2, 392 (2013).
- Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases. Cellular Immunology. 333, 65 (2018).
- Huffman, J. E., et al. Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research. Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).
- Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform. Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).
- Kristic, J., et al. Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).
- Nikolac, P. M., et al. The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index. Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).
- Liu, D., et al. The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia. Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).
- Lemmers, R., et al. IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations. Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).
- Wang, Y., et al. The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study. Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).
- Liu, D., et al. Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G. Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).
- Russell, A. C., et al. The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson’s disease. GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).
- Bones, J., Mittermayr, S., O’Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).
- Pucic, M., et al. High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations. Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).
- Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).
- Ren, S., et al. Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types. Cell Research. 26, 963 (2016).
