Análise de imunoglobulina G N-Glycan por cromatografia líquida de ultra-desempenho
Summary
A imunoglobulina G (IgG) N-glicano é caracterizada por meio de cromatografia de interação hidrofílica UPLC. Além disso, a estrutura do IgG N-glican é claramente separada. Apresentado aqui é uma introdução a este método experimental para que ele possa ser amplamente utilizado em ambientes de pesquisa.
Abstract
Glycomics é uma nova subespecialidade em pesquisa do sistema de omics que oferece um potencial significativo na descoberta de biomarcadores de última geração para a suscetibilidade à doença, descoberta de alvos de medicamentos e medicina de precisão. Os glicanos alternativos de IgG Nforam relatados em diversas doenças crônicas comuns e sugeridos ter o grande potencial em aplicações clínicas (isto é, biomarcadores para o diagnóstico e a predição das doenças). Os igg n-glicanos são amplamente caracterizados usando o método de cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC) cromatografia líquida de ultradesempenho (UPLC). A UPLC é uma tecnologia de detecção estável, com boa reprodutibilidade e alta precisão quantitativa relativa. Além disso, a estrutura do IgG N-glicano é claramente separada, e a composição glicana e a abundância relativa no plasma são caracterizadas.
Introduction
N-glicosilação de proteínas humanas é uma modificação pós-translacional comum e essencial1 e pode ajudar a prever a ocorrência e o desenvolvimento de doenças com relativa precisão. Devido à complexidade de sua estrutura, espera-se que existam mais de 5.000 estruturas glicanas, proporcionando grande potencial como biomarcadores diagnósticos e preditivos para doenças2. N-glicanos ligados à imunoglobulina G (IgG) têm se mostrado essenciais para a função da IgG, e a IgG N-glicosilação participa do equilíbrio entre os sistemas pró e antiinflamatórios3. A glicosilação diferencial igg nestá envolvida no desenvolvimento e progressão da doença, representando tanto uma predisposição quanto um mecanismo funcional envolvido na patologia da doença. O papel inflamatório do IgG N-glicosilação tem sido associado ao envelhecimento, doenças inflamatórias, doenças autoimunes e câncer4.
Com o desenvolvimento da tecnologia de detecção, os seguintes métodos são mais amplamente utilizados em glifosas de alta produtividade: cromatografia de interação hidrofílica (HILIC) cromatografia líquida de ultradesempenho com detecção de fluorescência (UPLC-FLR), eletroforese de gel capilar multiplex com fluores induzidos por laser detecção de cência (xCGE-LIF), desintoxicação/ionização assistida por matriz tipode espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS) e espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-ESI-MS) . Estes métodos superaram deficiências anteriores de baixo fluxo, resultados instáveis e baixa especificidade de sensibilidade5,6.
UPLC é amplamente utilizado para explorar a associação entre IgG N-glicosilação e certas doenças (ou seja, envelhecimento7, obesidade8, disslipidemia9, diabetes tipo II10, hipertensão11, acidente vascular cerebral isquêmico12, e doença de Parkinson13). Em comparação com os outros três métodos acima mencionados, uplc tem as seguintes vantagens5,14. Primeiro, ele fornece um método de análise quantitativa relativa, e a análise de dados que envolve a normalização total da área melhora a comparabilidade de cada amostra. Em segundo lugar, o custo do equipamento e a experiência necessária são relativamente baixos, o que facilita a implementação e transformação de biomarcadores de glicosilação em aplicações clínicas. Apresentado aqui é uma introdução ao UPLC para que ele possa ser mais amplamente utilizado.
Protocol
Representative Results
Discussion
UPLC serve como um método de análise quantitativa relativa5,15. Os resultados indicam que o UPLC é uma tecnologia de detecção estável, com boa reprodutibilidade e precisão quantitativa relativa. A quantidade de glicanos em cada pico é expressa como uma porcentagem da área integrada total usando UPLC, que é o valor relativo. A quantificação relativa melhora a comparabilidade das amostras de teste. Além disso, 96 placas G de proteína bem são usadas p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por doações da National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) e da Australian-China Collaborative Grant (NH & MRC – APP1112767 -NSFC 81561128020).
Materials
| 2-aminobenzamide, 2-AB | Sigma, China | ||
| 96-well collection plate | AXYGEN | ||
| 96-well filter plate | Pol | 0.45 um GHP | |
| 96-well monolithic plate | BIA Separations | ||
| 96-well plate rotor | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Acetic acid | Sigma, China | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Ammonium bicarbonate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Ammonium formate | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Constant shaking incubator/rocker | Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China | ZWY-10313 | |
| Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column | Watts technology Co., Ltd, China | BEH column | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma, China | ||
| Disodium phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Electric ovens | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Formic acid | Sigma, China | ||
| GlycoProfile 2-AB Labeling kit | Sigma, China | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, China | ||
| High-speed centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 5430 | |
| Igepal | Sigma, China | ||
| Low temperature centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | ||
| Low temperature refrigerator | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Manifold 96-well plate | Watts technology Co., Ltd, China | 186001831 | |
| Methanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Milli-Q pure water meter | Millipore Co., Ltd, America | Advantage A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| PH tester | Sartorius Co., Ltd, Germany | PB-10 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Pipette | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl | |
| PNGase F enzyme | Sigma, China | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Propan-2-ol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| SDS | Sigma, China | ||
| Sodium chloride | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma, China | ||
| Spectrophotometer | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Transfer liquid gun | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China | 4672100 | |
| Tris | Amresco, America | ||
| Ultra-low temperature refrigerator | Thermo Co., Ltd, America | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| Ultra-performance liquid chromatography | Watts technology Co., Ltd, China | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Vacuum Pump | Watts technology Co., Ltd, China | 725000604 | |
| Volatilizing machine/Dryer | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China | NP-30S | |
| Water-bath | Tester instruments Co., Ltd | DK-98-IIA | |
| Weighing balance | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | MP200B |
References
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