Immunglobulin G N-Glycan Analyse durch Ultra-Performance Liquid Chromatographie
Summary
Immunglobulin G (IgG) N-Glycanwird durch hydrophile Wechselwirkungschromatographie UPLC charakterisiert. Darüber hinaus ist die Struktur von IgG N-Glycan klar getrennt. Hier wird eine Einführung in diese experimentelle Methode vorgestellt, so dass sie in der Forschung weit verbreitet werden kann.
Abstract
Glycomics ist eine neue Spezialität in der Omics-Systemforschung, die ein erhebliches Potenzial bei der Entdeckung von Biomarkern der nächsten Generation für Krankheitsanfälligkeit, Wirkstoffzielforschung und Präzisionsmedizin bietet. Alternative IgG N-Glykane wurden bei mehreren häufigen chronischen Krankheiten berichtet und schlugen vor, großes Potenzial in klinischen Anwendungen zu haben (d. h. Biomarker für die Diagnose und Vorhersage von Krankheiten). IgG N-Glykane sind weithin charakterisiert mit dem Verfahren der hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie (UPLC). UPLC ist eine stabile Detektionstechnologie mit guter Reproduzierbarkeit und hoher relativer quantitativer Genauigkeit. Darüber hinaus ist die Struktur von IgG N-Glycan klar getrennt, und Glyzanzusammensetzung und relative Häufigkeit im Plasma sind charakterisiert.
Introduction
N-Glykosylierung menschlicher Proteine ist eine häufige und wesentliche posttranslationale Modifikation1 und kann dazu beitragen, das Auftreten und die Entwicklung von Krankheiten relativ genau vorherzusagen. Aufgrund der Komplexität seiner Struktur, es wird erwartet, dass es mehr als 5.000 Glykanstrukturen, die großes Potenzial als diagnostische und prädiktive Biomarker für Krankheiten2. N-Glykane, die an Immunglobulin G (IgG) angeschlossen sind, haben sich als wesentlich für die Funktion von IgG erwiesen, und IgG-N-Glykosylierung beteiligt sich am Gleichgewicht zwischen den pro- und entzündungshemmenden Systemen3. Differential-IgG N-Glykosylierung ist an der Entwicklung und Progression von Krankheiten beteiligt, was sowohl eine Veranlagung als auch einen funktionellen Mechanismus darstellt, der an der Krankheitspathologie beteiligt ist. Die entzündliche Rolle der IgG N-Glykosylierung wurde mit Alterung, entzündlichen Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen und Krebs assoziiert4.
Mit der Entwicklung der Detektionstechnik Die folgenden Methoden werden am häufigsten in Glykomik mit hohem Durchsatz eingesetzt: hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie mit Fluoreszenzdetektion (UPLC-FLR), Multiplex-Kapillargelelektrophorese mit laserinduzierten Fluores Cence Detection (xCGE-LIF), matrixgestützte Laser-Desorption/Ionisationszeit-massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) und Flüssigchromatographie-Elektrospray-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS) . Diese Methoden haben frühere Mängel des niedrigen Flusses, instabile Ergebnisse und schlechte Empfindlichkeitsspezifität5,6überwunden.
UPLC ist weit verbreitet, um den Zusammenhang zwischen IgG N-Glykosylierung und bestimmten Krankheiten zu erforschen (d.h. Alterung7, Adipositas8, Dyslipidämie9, Typ-II-Diabetes10, Bluthochdruck11, ischämischer Schlaganfall12, und Parkinson-Krankheit13). Im Vergleich zu den anderen drei oben genannten Methoden hat UPLC die folgenden Vorteile5,14. Erstens bietet es eine relative quantitative Analysemethode, und die Datenanalyse, die die Gesamtflächennormalisierung umfasst, verbessert die Vergleichbarkeit jeder Stichprobe. Zweitens sind die Kosten für Ausrüstung und das erforderliche Know-how relativ gering, was die Implementierung und Umwandlung von Glykosylierungsbiomarkern in klinische Anwendungen erleichtert. Hier wird eine Einführung in UPLC vorgestellt, damit es weiter verbreitet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
UPLC dient als relative quantitative Analysemethode5,15. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass UPLC eine stabile Detektionstechnologie mit guter Reproduzierbarkeit und relativer quantitativer Genauigkeit ist. Die Menge an Glykanen in jedem Peak wird als Prozentsatz der gesamten integrierten Fläche mit UPLC ausgedrückt, was der relative Wert ist. Die relative Quantifizierung verbessert die Vergleichbarkeit von Testproben. Darüber hinaus werden 96 Well-Protein-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) und des Australian-China Collaborative Grant (NH & MRC – APP1112767 -NSFC 81561128020) unterstützt.
Materials
| 2-aminobenzamide, 2-AB | Sigma, China | ||
| 96-well collection plate | AXYGEN | ||
| 96-well filter plate | Pol | 0.45 um GHP | |
| 96-well monolithic plate | BIA Separations | ||
| 96-well plate rotor | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Acetic acid | Sigma, China | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Ammonium bicarbonate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Ammonium formate | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Constant shaking incubator/rocker | Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China | ZWY-10313 | |
| Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column | Watts technology Co., Ltd, China | BEH column | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma, China | ||
| Disodium phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Electric ovens | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Formic acid | Sigma, China | ||
| GlycoProfile 2-AB Labeling kit | Sigma, China | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, China | ||
| High-speed centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 5430 | |
| Igepal | Sigma, China | ||
| Low temperature centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | ||
| Low temperature refrigerator | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Manifold 96-well plate | Watts technology Co., Ltd, China | 186001831 | |
| Methanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Milli-Q pure water meter | Millipore Co., Ltd, America | Advantage A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| PH tester | Sartorius Co., Ltd, Germany | PB-10 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Pipette | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl | |
| PNGase F enzyme | Sigma, China | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Propan-2-ol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| SDS | Sigma, China | ||
| Sodium chloride | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma, China | ||
| Spectrophotometer | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Transfer liquid gun | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China | 4672100 | |
| Tris | Amresco, America | ||
| Ultra-low temperature refrigerator | Thermo Co., Ltd, America | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| Ultra-performance liquid chromatography | Watts technology Co., Ltd, China | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Vacuum Pump | Watts technology Co., Ltd, China | 725000604 | |
| Volatilizing machine/Dryer | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China | NP-30S | |
| Water-bath | Tester instruments Co., Ltd | DK-98-IIA | |
| Weighing balance | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | MP200B |
References
- Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).
- Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21 (1), (2014).
- Shade, K. T. C., Anthony, R. M. Antibody Glycosylation and Inflammation. Antibodies. 2, 392 (2013).
- Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases. Cellular Immunology. 333, 65 (2018).
- Huffman, J. E., et al. Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research. Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).
- Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform. Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).
- Kristic, J., et al. Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).
- Nikolac, P. M., et al. The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index. Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).
- Liu, D., et al. The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia. Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).
- Lemmers, R., et al. IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations. Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).
- Wang, Y., et al. The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study. Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).
- Liu, D., et al. Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G. Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).
- Russell, A. C., et al. The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson’s disease. GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).
- Bones, J., Mittermayr, S., O’Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).
- Pucic, M., et al. High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations. Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).
- Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).
- Ren, S., et al. Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types. Cell Research. 26, 963 (2016).
