Immunoglobuline G N-Glycan Analysis par Ultra-Performance Liquid Chromatography
Summary
Immunoglobulin G (IgG) N-glycanest caractérisé en utilisant la chromatographie d’interaction hydrophile UPLC. En outre, la structure de IgG N-glycan est clairement séparée. Présenté ici est une introduction à cette méthode expérimentale afin qu’il puisse être largement utilisé dans les milieux de recherche.
Abstract
Glycomics est une nouvelle sous-spécialité dans la recherche sur les systèmes d’omiques qui offre un potentiel significatif dans la découverte de biomarqueurs de prochaine génération pour la susceptibilité aux maladies, la découverte de cibles médicamenteuses et la médecine de précision. D’autres IgG N-glycans ont été rapportés dans plusieurs maladies chroniques communes et suggérés pour avoir le grand potentiel dans des applications cliniques (c.-à-d., biomarqueurs pour le diagnostic et la prévision des maladies). IgG N-glycans sont largement caractérisés en utilisant la méthode de chromatographie d’interaction hydrophile (HILIC) chromatographie liquide ultra-performance (UPLC). UPLC est une technologie de détection stable avec une bonne reproductibilité et une précision quantitative relative élevée. En outre, la structure de L’IgG N-glycan est clairement séparée, et la composition de glycane et l’abondance relative dans le plasma sont caractérisées.
Introduction
N-glycosylation des protéines humaines est unemodification post-traduction n 1 commune et essentielle et peut aider à prédire l’occurrence et le développement des maladies de façon relativement précise. En raison de la complexité de sa structure, on s’attend à ce qu’il y ait plus de 5 000 structures de glycane, offrant un grand potentiel en tant que biomarqueurs diagnostiques et prédictifs pour les maladies2. N-glycansattachés à l’immunoglobuline G (IgG) se sont avérés essentiels pour la fonction d’IgG, et IgG N-glycosylation participe à l’équilibre entre les systèmes pro- et anti-inflammatoires3. L’IgG N-glycosylation différentielle est impliquée dans le développement et la progression de la maladie, représentant à la fois une prédisposition et un mécanisme fonctionnel impliqué dans la pathologie de la maladie. Le rôle inflammatoire de L’IgG N-glycosylation a été associé au vieillissement, aux maladies inflammatoires, aux maladies auto-immunes et au cancer4.
Avec le développement de la technologie de détection, les méthodes suivantes sont les plus largement utilisées dans les glycomics à haut débit : chromatographie d’interaction hydrophile (HILIC) chromatographie liquide ultra-performante avec détection de fluorescence (UPLC-FLR), électrophoresis de gel capillaire multiplex avec fluorescence induite par laser détection (xCGE-LIF), spectrométrie de masse laser assistée par matrice /ionisation (MALDI-TOF-MS) et spectrométrie de masse électrospray de chromatographie liquide (LC-ESI-MS) . Ces méthodes ont surmonté les lacunes précédentes de faible flux, des résultats instables, et une faible spécificité de sensibilité5,6.
UPLC est largement utilisé pour explorer l’association entre IgG N-glycosylation et certaines maladies (c.-à-d., vieillissement7, obésité8, dyslipidémie9, diabète de type II10, hypertension11, accident vasculaire cérébral ischémique12, et la maladie de Parkinson13). Par rapport aux trois autres méthodes mentionnées ci-dessus, UPLC a les avantages suivants5,14. Tout d’abord, il fournit une méthode relative d’analyse quantitative, et l’analyse des données qui implique la normalisation totale de la zone améliore la comparabilité de chaque échantillon. Deuxièmement, le coût de l’équipement et l’expertise requise sont relativement faibles, ce qui facilite la mise en œuvre et la transformation des biomarqueurs de glycosylation en applications cliniques. Présenté ici est une introduction à UPLC afin qu’il puisse être plus largement utilisé.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’UPLC sert de méthode d’analyse quantitative relative5,15. Les résultats indiquent que l’UPLC est une technologie de détection stable avec une bonne reproductibilité et une précision quantitative relative. La quantité de glycanes dans chaque pic est exprimée en pourcentage de la superficie totale intégrée à l’aide de l’UPLC, qui est la valeur relative. La quantification relative améliore la comparabilité des échantillons d’essai. En outre, 96 plaque…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été appuyés par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (81673247 et 81872682) et de la subvention collaborative Australie-Chine (NH et MRC – APP1112767 -NSFC 81561128020).
Materials
| 2-aminobenzamide, 2-AB | Sigma, China | ||
| 96-well collection plate | AXYGEN | ||
| 96-well filter plate | Pol | 0.45 um GHP | |
| 96-well monolithic plate | BIA Separations | ||
| 96-well plate rotor | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Acetic acid | Sigma, China | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Ammonium bicarbonate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Ammonium formate | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Constant shaking incubator/rocker | Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China | ZWY-10313 | |
| Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column | Watts technology Co., Ltd, China | BEH column | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma, China | ||
| Disodium phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Electric ovens | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Formic acid | Sigma, China | ||
| GlycoProfile 2-AB Labeling kit | Sigma, China | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, China | ||
| High-speed centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 5430 | |
| Igepal | Sigma, China | ||
| Low temperature centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | ||
| Low temperature refrigerator | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Manifold 96-well plate | Watts technology Co., Ltd, China | 186001831 | |
| Methanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Milli-Q pure water meter | Millipore Co., Ltd, America | Advantage A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| PH tester | Sartorius Co., Ltd, Germany | PB-10 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Pipette | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl | |
| PNGase F enzyme | Sigma, China | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Propan-2-ol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| SDS | Sigma, China | ||
| Sodium chloride | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma, China | ||
| Spectrophotometer | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Transfer liquid gun | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China | 4672100 | |
| Tris | Amresco, America | ||
| Ultra-low temperature refrigerator | Thermo Co., Ltd, America | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| Ultra-performance liquid chromatography | Watts technology Co., Ltd, China | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Vacuum Pump | Watts technology Co., Ltd, China | 725000604 | |
| Volatilizing machine/Dryer | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China | NP-30S | |
| Water-bath | Tester instruments Co., Ltd | DK-98-IIA | |
| Weighing balance | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | MP200B |
References
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