High-Throughput Identificatie van resistentie tegen Pseudomonas syringae pv. Tomaat in Tomaat met seedling Flood Assay
Summary
De zaailing overstromingstest vergemakkelijkt een snelle screening van wilde tomaten toetredingen voor de weerstand tegen de Pseudomonas syringae bacterie. Deze test, gebruikt in combinatie met de zaailing bacteriële groei test, kan helpen bij het verder karakteriseren van de onderliggende weerstand tegen de bacterie, en kan worden gebruikt om het scherm mapping populaties om de genetische basis van resistentie te bepalen.
Abstract
Tomaat is een agronomisch belangrijk gewas dat kan worden geïnfecteerd door Pseudomonas syringae, een gram-negatieve bacterie, wat resulteert in bacteriële vlekziekte. De tomaat-P. syringae pv. tomaat pathosystem wordt veel gebruikt om de genetische basis van plantaardige aangeboren reacties en resistentie tegen ziekten te ontleden. Terwijl de ziekte met succes werd beheerd voor vele decennia door de invoering van de Pto / Prf gencluster van Solanum pimpinellifolium in gecultiveerde tomaat, ras 1 stammen van P. syringae zijn geëvolueerd om resistentie verleend door de Pto / Prf gencluster te overwinnen en wereldwijd optreden.
Wilde tomatensoorten zijn belangrijke reservoirs van natuurlijke diversiteit in pathogene herkenning, omdat ze evolueerden in verschillende omgevingen met verschillende pathogene druk. In typische schermen voor ziekteresistentie in wilde tomaat worden volwassen planten gebruikt, die het aantal planten kunnen beperken dat kan worden gescreend vanwege hun langere groeitijd en grotere groeiruimtevereisten. We ontwikkelden een methode om 10-dagen-oude tomatenzaailingen te screenen op resistentie, die de groeitijd van planten en de groeiruimte minimaliseert, een snelle omzet van planten mogelijk maakt en grote monstermaten laat testen. Zaailing resultaten van overleving of dood kan worden behandeld als discrete fenotypes of op een weerstand schaal gedefinieerd door de hoeveelheid nieuwe groei in overlevende zaailingen na overstromingen. Deze methode is geoptimaliseerd om 10-dagen-oude tomatenzaailingen te screenen op weerstand tegen twee P. syringae stammen en kan gemakkelijk worden aangepast aan andere P. syringae stammen.
Introduction
Pseudomonas syringae is een Gram-negatieve pathogene bacterie die een breed scala aan plantengastheren infecteert. Bacteriën komen de gastheer plant door de stomata of fysieke wonden en vermenigvuldigen zich in de apoplast1. Planten hebben een tweeledige immuunrespons ontwikkeld om te beschermen tegen infectie door bacteriële pathogenen. Het eerste niveau vindt plaats op het plantenceloppervlak, waar patroonherkenningsreceptoren op het plantencelmembraan zeer geconserveerde pathogene moleculaire patronen (PP’s) waarnemen in een proces genaamd PAMP-triggered immunity (PTI)2. Tijdens dit proces, de gastheer plant upregulates defensie respons trajecten, met inbegrip van depositie van callose aan de celwand, sluiting van stomata, de productie van reactieve zuurstofsoorten, en inductie van pathogenese-gerelateerde genen.
Bacteriën kunnen PTI overwinnen door gebruik te maken van een type III secretiesysteem om eiwitten, zogenaamde effectoren, rechtstreeks in de plantencel te leveren3. Effector eiwitten richten zich meestal op componenten van PTI en bevorderen ziekteverwekkervirulentie4. De tweede laag van plantenimmuniteit treedt op in de plantencel bij de herkenning van de effectoreiwitten. Deze erkenning is afhankelijk van weerstandsgenen, die nucleotide-bindende plaats leucine-rijke herhaling die receptoren (NLRs) bevat coderen. Nlrs zijn in staat om ofwel direct effectoren te herkennen of hun activiteit te herkennen op een virulentiedoel of lokkracht5. Ze activeren dan een secundaire immuunrespons in een proces genaamd effector-triggered immunity (ETI), die vaak wordt geassocieerd met een overgevoelige respons (HR), een vorm van gelokaliseerde celdood op de plaats van infectie6. In tegenstelling tot gen-voor-genresistentie geassocieerd met ETI, kunnen planten kwantitatieve gedeeltelijke resistentie vertonen, die afhankelijk is van de bijdrage van meerdere genen7.
P. syringae pv. tomaat (Pst) is het oorzakelijke middel van bacteriële vlek op tomaat en is een hardnekkig landbouwprobleem. Overheersende stammen in het veld zijn meestal Pst race 0 stammen die een van beide of beide van het type III effectors AvrPto en AvrPtoB uitdrukken. DC3000(PstDC3000) is een representatieve ras 0 stam en een model ziekteverwekker die bacteriële vlek in tomaat kan veroorzaken. Om bacteriële vlekziekte te bestrijden, hebben fokkers de Pto [P. syringae pv. tomaat]/Prf [Pto-resistentie en fenthiongevoeligheid] gencluster van de wilde tomatensoorten Solanum pimpinellifolium in moderne cultivars8,9. Het Pto-gen codeert een serine-threonine eiwit kinase die samen met het Prf NLR weerstand verleent tegen PstDC3000 via erkenning van de effectoren AvrPto en AvrPtoB10,11,12,13,14. Deze weerstand is echter niet effectief tegen opkomende rassen 1 stammen, waardoor hun snelle en agressieve spreiding in de afgelopen jaren15,16. Race 1 stammen ontwijken erkenning door de Pto / Prf cluster, omdat AvrPto is ofwel verloren of gemuteerd in deze stammen, en AvrPtoB lijkt te accumuleren minimaal15,17,18.
Wilde tomatenpopulaties zijn belangrijke reservoirs van natuurlijke variatie voor Pst resistentie en zijn eerder gebruikt om potentiële resistentie loci19,20,21te identificeren . Echter, de huidige schermen voor pathogene resistentie gebruik maken van 4-5 weken oude volwassen planten20,21. Daarom worden ze beperkt door groeitijd, groeiruimte en relatief kleine steekproefgroottes. Om de beperkingen van conventionele benaderingen aan te pakken, ontwikkelden we een high-throughput tomaat P. syringae resistentie test met behulp van 10-dagen-oude tomatenzaailingen22. Deze aanpak biedt verschillende voordelen ten opzichte van het gebruik van volwassen planten: namelijk kortere groeitijd, verminderde ruimtevereisten en een hogere doorvoer. Bovendien hebben we aangetoond dat deze aanpak getrouw de ziekteresistentie fenotypes in volwassen planten recapituleert22.
In de zaailing overstroming assay beschreven in dit protocol, tomaten zaailingen worden geteeld op petrischaaltjes van steriele Murashige en Skoog (MS) media gedurende 10 dagen en vervolgens worden overspoeld met een inentingum met de bacteriën van belang en een oppervlakteactieve stof. Na overstromingen kunnen zaailingen kwantitatief worden geëvalueerd op ziekteresistentie via bacteriële groeitesten. Bovendien kan het overleven of de dood van zaailing fungeren als een discrete resistentie of ziekte fenotype 7-14 dagen na overstromingen. Deze aanpak biedt een high-throughput alternatief voor het screenen van grote aantallen wilde tomaten toetredingen voor resistentie tegen Pst ras 1 stammen, zoals Pst stam T1 (PstT1), en kan gemakkelijk worden aangepast aan andere bacteriële stammen van belang.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een protocol voor overstromingsinenting met PstDC3000 of PstT1 geoptimaliseerd om resistentie tegen deze bacteriële stammen in tomatenzaailingen te detecteren wordt beschreven. Er zijn verschillende kritische parameters voor optimale resultaten in de zaailing resistentie test, met inbegrip van bacteriële concentratie en oppervlakteactieve concentratie, die empirisch werden bepaald22. Voor PstDC3000 werd de optische dichtheid geoptimaliseerd om volledige overleving te b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Jamie Calma voor het testen van het effect van media-volume op ziekte of resistentie resultaten. Wij danken Dr. Maël Baudin en Dr. Karl J. Scheiber van het Lewis Lab voor het geven van constructieve opmerkingen en suggesties over het manuscript. Het onderzoek naar plantenimmuniteit in het Lewis-laboratorium werd ondersteund door het USDA ARS 2030-21000-046-00D en 2030-21000-050-00D (JDL) en het NSF Directoraat biologische wetenschappen IOS-1557661 (JDL).
Materials
| 3M Tape Micropore 1/2" x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m) | VWR International | 56222-182 | |
| 3mm borosilicate glass beads | Friedrich & Dimmock | GB3000B | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Biophotometer Plus | Eppendorf | E952000006 | |
| Biosafety cabinet, class II type A2 | |||
| BRAND Disposable Plastic Cuvettes, Polystyrene | VWR International | 47744-642 | |
| Chenille Kraft Flat Wood Toothpicks | VWR International | 500029-808 | |
| cycloheximide | Research Products International | C81040-5.0 | |
| Dibasic potassium phosphate anhydrous, ACS grade | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Dimethylformamide | |||
| Dissecting microscope (Magnification of at least 10x) | |||
| Ethanol – 190 Proof | |||
| Falcon polystyrene 96 well microplates, flat-bottom | Fisher Scientific | 08-772-3 | |
| Glass Alcohol Burner Wick | Fisher Scientific | S41898A / No. W-125 | |
| Glass Alcohol Burners | Fisher Scientific | S41898 / No. BO125 | |
| Glycerol ACS reagent | VWR International | EMGX0185-5 | |
| Kimberly-Clark™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Magnesium chloride, ACS grade | VWR International | 97061-356 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, ACS grade | VWR International | 97062-130 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | |||
| Microcentrifuge tubes, 2.2 mL | |||
| Mini Beadbeater-96, 115 volt | Bio Spec Products Inc. | 1001 | |
| Murashige & Skoog, Basal Salts | Caisson Laboratories, Inc. | MSP01-50LT | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL | Rainin | L8-200XLS | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL | Rainin | L8-20XLS | |
| Polystyrene 100mm x 25mm sterile petri dish | VWR International | 89107-632 | |
| Polystyrene 150mm x 15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | FB08-757-14 | |
| Polystyrene 150x15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (defined as 100% bleach) | Staples | 1013131 | |
| Rifampicin | Gold Biotechnology | R-120-25 | |
| Silwet L-77 (non-ionic organosilicone surfactant co-polymer C13H34O4Si3 surfactant) | Fisher Scientific | NCO138454 | |
| Tips LTS 20 μL 960/10 GPS-L10 | Rainin | 17005091 | |
| Tips LTS 250 μL 960/10 GPS-L250 | Rainin | 17005093 | |
| VWR dissecting forceps fine tip, 4.5" | VWR International | 82027-386 |
References
- Underwood, W., Melotto, M., He, S. Y. Role of plant stomata in bacterial invasion. Cell Microbiology. 9 (7), 1621-1629 (2007).
- Zipfel, C. Early molecular events in PAMP-triggered immunity. Current Opinion in Plant Biology. 12 (4), 414-420 (2009).
- Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
- Lewis, J. D., Desveaux, D., Guttman, D. S. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Seminars in Cell and Developmental Biology. 20 (9), 1055-1063 (2009).
- Schreiber, K. J., Baudin, M., Hassan, J. A., Lewis, J. D. Die another day: molecular mechanisms of effector-triggered immunity elicited by type III secreted effector proteins. Seminars in Cell and Developmental Biology. 56, 124-133 (2016).
- Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Molecular Biology. 44 (3), 321-334 (2000).
- Boyd, L. A., Ridout, C., O’Sullivan, D. M., Leach, J. E., Leung, H. Plant-pathogen interactions: disease resistance in modern agriculture. Trends in Genetics. 29 (4), 233-240 (2013).
- Pitblado, R. E., MacNeill, B. H. Genetic basis of resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato in field tomatoes. Canadian Journal of Plant Pathology. 5 (4), 251-255 (1983).
- Pedley, K. F., Martin, G. B. Molecular basis of Pto-mediated resistance to bacterial speck disease in tomato. Annual Reviews of Phytopathology. 41, 215-243 (2003).
- Ronald, P. C., Salmeron, J. M., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. The cloned avirulence gene AvrPto induces disease resistance in tomato cultivars containing the Pto resistance gene. Journal of Bacteriology. 174 (5), 1604-1611 (1992).
- Martin, G. B., et al. Map-based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistance in tomato. Science. 262 (5138), 1432-1436 (1993).
- Salmeron, J. M., Barker, S. J., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. Tomato mutants altered in bacterial disease resistance provide evidence for a new locus controlling pathogen recognition. Plant Cell. 6 (4), 511-520 (1994).
- Salmeron, J. M., et al. Tomato Prf is a member of the leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes and lies embedded within the Pto kinase gene cluster. Cell. 86 (1), 123-133 (1996).
- Scofield, S. R., et al. Molecular basis of gene-for-gene specificity in bacterial speck disease of tomato. Science. 274 (5295), 2063-2065 (1996).
- Kunkeaw, S., Tan, S., Coaker, G. Molecular and evolutionary analyses of Pseudomonas syringae pv. tomato race 1. Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (4), 415-424 (2010).
- Cai, R., et al. The plant pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato is genetically monomorphic and under strong selection to evade tomato immunity. PLoS Pathogens. 7 (8), 1002130 (2011).
- Almeida, N. F., et al. A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Molecular Plant-Microbe Interactions. 22 (1), 52-62 (2009).
- Lin, N. C., Abramovitch, R. B., Kim, Y. J., Martin, G. B. Diverse AvrPtoB homologs from several Pseudomonas syringae pathovars elicit Pto-dependent resistance and have similar virulence activities. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 702-712 (2006).
- Rose, L. E., Langley, C. H., Bernal, A. J., Michelmore, R. W. Natural variation in the Pto pathogen resistance gene within species of wild tomato (Lycopersicon). I. Functional analysis of Pto alleles. 遗传学. 171 (1), 345-357 (2005).
- Thapa, S. P., Miyao, E. M., Davis, R. M., Coaker, G. Identification of QTLs controlling resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1 strains from the wild tomato Solanum habrochaites LA1777. Theoretical and Applied Genetics. 128 (4), 681-692 (2015).
- Bao, Z. L., et al. Identification of a candidate gene in Solanum habrochaites for resistance to a race 1 strain of Pseudomonas syringae pv. tomato. Plant Genome. 8 (3), 1-15 (2015).
- Hassan, J. A., Zhou, Y. J., Lewis, J. D. A rapid seedling resistance assay identifies wild tomato lines that are resistant to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1. Molecular Plant-Microbe Interactions. 30 (9), 701-709 (2017).
- King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 44 (2), 301-307 (1954).
- Uppalapati, S. R., et al. Pathogenicity of Pseudomonas syringae pv. tomato on tomato seedlings: phenotypic and gene expression analyses of the virulence function of coronatine. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (4), 383-395 (2008).
- Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock. PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).
- Lu, H., McClung, C. R., Zhang, C. Tick tock: circadian regulation of plant innate immunity. Annual Review of Phytopathology. 55, 287-311 (2017).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Nature. 470 (7332), 110-114 (2011).
