Identificación de alto rendimiento de la resistencia a Pseudomonas syringae pv. Tomate en tomate usando el ensayo de inundación de plántulas
Summary
El ensayo de inundación de plántulas facilita el cribado rápido de las adhesiones de tomate silvestre para la resistencia a la bacteria pseudomonas de las siestas. Este ensayo, utilizado junto con el ensayo de crecimiento bacteriano de plántulas, puede ayudar a caracterizar aún más la resistencia subyacente a la bacteria, y se puede utilizar para examinar las poblaciones de mapeo para determinar la base genética de la resistencia.
Abstract
El tomate es un cultivo de importancia agronómica que puede ser infectado por Pseudomonas syringae,una bacteria Gram-negativa, lo que resulta en la enfermedad bacteriana de la mota. El tomateP. syringae pv. el pathosistema de tomate se utiliza ampliamente para diseccionar la base genética de las respuestas innatas de las plantas y la resistencia a las enfermedades. Mientras que la enfermedad se manejó con éxito durante muchas décadas a través de la introducción del grupo de genes Pto/Prf de Solanum pimpinellifolium en tomate cultivado, las cepas de la raza 1 de P. syringae han evolucionado para superar la resistencia conferida por el grupo de genes Pto/Prf y se producen en todo el mundo.
Las especies de tomate sin efecto son importantes reservorios de diversidad natural en el reconocimiento de patógenos, ya que evolucionaron en diversos ambientes con diferentes presiones de patógenos. En las pantallas típicas para la resistencia a las enfermedades en el tomate silvestre, se utilizan plantas adultas, que pueden limitar el número de plantas que se pueden examinar debido a su mayor tiempo de crecimiento y mayores requisitos de espacio de crecimiento. Desarrollamos un método para detectar resistencia a las plántulas de tomate de 10 días de edad, lo que minimiza el tiempo de crecimiento de las plantas y el espacio de la cámara de crecimiento, permite una rápida rotación de plantas y permite probar grandes tamaños de muestra. Los resultados de supervivencia o muerte pueden tratarse como fenotipos discretos o en una escala de resistencia definida por la cantidad de nuevo crecimiento en las plántulas supervivientes después de las inundaciones. Este método se ha optimizado para examinar las plántulas de tomate de 10 días de edad para la resistencia a dos cepas de P. syringae y se puede adaptar fácilmente a otras cepas de P. syringae.
Introduction
Pseudomonas syringae es una bacteria patógena Gram-negativa que infecta una amplia gama de huéspedes de plantas. Las bacterias entran en la planta huésped a través de los estomas o heridas físicas y proliferan en el apoplast1. Las plantas han desarrollado una respuesta inmune de dos niveles para proteger contra la infección por patógenos bacterianos. El primer nivel se produce en la superficie de la célula vegetal, donde los receptores de reconocimiento de patrones en la membrana celular de la planta perciben patrones moleculares asociados a patógenos altamente conservados (PamP) en un proceso llamado inmunidad desencadenada por PAMP (PTI)2. Durante este proceso, la planta anfitriona regula las vías de respuesta de defensa, incluyendo la deposición de calisa a la pared celular, el cierre de estomas, la producción de especies reactivas de oxígeno e la inducción de genes relacionados con la patogénesis.
Las bacterias pueden superar la PTI mediante la utilización de un sistema de secreción de tipo III para suministrar proteínas, llamadas efectores, directamente en la célula de la planta3. Las proteínas efectoras comúnmente se dirigen a los componentes de la PTI y promueven la virulencia de patógenos4. El segundo nivel de inmunidad de la planta se produce dentro de la célula vegetal tras el reconocimiento de las proteínas efectoras. Este reconocimiento depende de los genes de resistencia, que codifican la repetición rica en leucina (NRM) del sitio de unión a nucleótidos. Las NLE son capaces de reconocer a los efectores directamente o reconocer su actividad en un objetivo de virulencia o señuelo5. A continuación, desencadenan una respuesta inmune secundaria en un proceso llamado inmunidad desencadenada por el efector (ETI), que a menudo se asocia con una respuesta hipersensible (HR), una forma de muerte celular localizada en el sitio de la infección6. A diferencia de la resistencia gen-por-genes asociada con la ETI, las plantas pueden exhibir resistencia parcial cuantitativa, que depende de la contribución de múltiples genes7.
P. syringae pv. el tomate (Pst) es el agente causal de la mota bacteriana en el tomate y es un problema agrícola persistente. Las cepas predominantes en el campo han sido típicamente Pst raza 0 cepas que expresan uno o ambos de los efectores tipo III AvrPto y AvrPtoB. DC3000 (PstDC3000) es una cepa representativa de raza 0 y un patógeno modelo que puede causar mota bacteriana en el tomate. Para combatir la enfermedad bacteriana de la mota, los criadores introgresieron el grupo de genes Pto [P. syringae pv. tomate]/Prf [Resistencia al pto y sensibilidad al fentionamiento] de las especies de tomates silvestres Solanum pimpinellifolium en cultivares modernos8,9. El gen Pto codifica una proteína quinasa de serina-talonina que, junto con el Prf NLR, confiere resistencia a PstDC3000 mediante el reconocimiento de los efectores AvrPto y AvrPtoB10,11,12,13,14. Sin embargo, esta resistencia es ineficaz contra las cepas emergentes de la raza 1, permitiendo su rápida y agresiva propagación en los últimos años15,16. Las cepas de la raza 1 evaden el reconocimiento por parte del clúster Pto/Prf, ya que AvrPto se pierde o muta en estas cepas, y AvrPtoB parece acumularse mínimamente15,17,18.
Las poblaciones de tomate silvestre son importantes reservorios de variación natural para la resistencia Pst y se han utilizado previamente para identificar la resistencia potencial loci19,20,21. Sin embargo, las pantallas actuales para la resistencia a patógenos utilizan plantas adultas de 4 a 5 semanas de edad20,21. Por lo tanto, están limitados por el tiempo de crecimiento, el espacio de la cámara de crecimiento y los tamaños de muestra relativamente pequeños. Para hacer frente a las limitaciones de los enfoques convencionales, desarrollamos un ensayo de resistencia a las siringas de tomate de alto rendimiento utilizando plántulas de tomate de 10 días de edad22. Este enfoque ofrece varias ventajas sobre el uso de plantas adultas: a saber, un menor tiempo de crecimiento, menores requisitos de espacio y un mayor rendimiento. Además, hemos demostrado que este enfoque recapitula fielmente los fenotipos de resistencia a la enfermedad observados en plantas adultas22.
En el ensayo de inundación de plántulas descrito en este protocolo, las plántulas de tomate se cultivan en platos Petri de medios estériles de Murashige y Skoog (MS) durante 10 días y luego se inundan con un inóculo que contiene las bacterias de interés y un tensioactivo. Después de las inundaciones, las plántulas pueden ser evaluadas cuantitativamente para la resistencia a la enfermedad a través de ensayos de crecimiento bacteriano. Además, la supervivencia de la plántula o la muerte pueden actuar como una resistencia discreta o fenotipo de enfermedad 7-14 días después de la inundación. Este enfoque ofrece una alternativa de alto rendimiento para el cribado de un gran número de adhesiones de tomate silvestre para la resistencia a las cepas de la raza Pst 1, como la cepa Pst T1 (PstT1), y se puede adaptar fácilmente a otras cepas bacterianas de interés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se describe un protocolo para la inoculación por inundación con PstDC3000 o PstT1 optimizado para detectar resistencia a estas cepas bacterianas en plántulas de tomate. Existen varios parámetros críticos para obtener resultados óptimos en el ensayo de resistencia a la plántula, incluida la concentración bacteriana y la concentración de surfactantes, que se determinaron empíricamente22. Para PstDC3000, la densidad óptica fue optimizada para lograr una supervive…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Jamie Calma por probar el efecto del volumen de los medios en los resultados de enfermedades o resistencia. Agradecemos al Dr. Maél Baudin y al Dr. Karl J. Scheiber del Laboratorio Lewis por proporcionar comentarios constructivos y sugerencias sobre el manuscrito. La investigación sobre la inmunidad vegetal en el laboratorio Lewis fue apoyada por el USDA ARS 2030-21000-046-00D y 2030-21000-050-00D (JDL), y la Dirección de Ciencias Biológicas de la NSF IOS-1557661 (JDL).
Materials
| 3M Tape Micropore 1/2" x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m) | VWR International | 56222-182 | |
| 3mm borosilicate glass beads | Friedrich & Dimmock | GB3000B | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Biophotometer Plus | Eppendorf | E952000006 | |
| Biosafety cabinet, class II type A2 | |||
| BRAND Disposable Plastic Cuvettes, Polystyrene | VWR International | 47744-642 | |
| Chenille Kraft Flat Wood Toothpicks | VWR International | 500029-808 | |
| cycloheximide | Research Products International | C81040-5.0 | |
| Dibasic potassium phosphate anhydrous, ACS grade | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Dimethylformamide | |||
| Dissecting microscope (Magnification of at least 10x) | |||
| Ethanol – 190 Proof | |||
| Falcon polystyrene 96 well microplates, flat-bottom | Fisher Scientific | 08-772-3 | |
| Glass Alcohol Burner Wick | Fisher Scientific | S41898A / No. W-125 | |
| Glass Alcohol Burners | Fisher Scientific | S41898 / No. BO125 | |
| Glycerol ACS reagent | VWR International | EMGX0185-5 | |
| Kimberly-Clark™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Magnesium chloride, ACS grade | VWR International | 97061-356 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, ACS grade | VWR International | 97062-130 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | |||
| Microcentrifuge tubes, 2.2 mL | |||
| Mini Beadbeater-96, 115 volt | Bio Spec Products Inc. | 1001 | |
| Murashige & Skoog, Basal Salts | Caisson Laboratories, Inc. | MSP01-50LT | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL | Rainin | L8-200XLS | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL | Rainin | L8-20XLS | |
| Polystyrene 100mm x 25mm sterile petri dish | VWR International | 89107-632 | |
| Polystyrene 150mm x 15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | FB08-757-14 | |
| Polystyrene 150x15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (defined as 100% bleach) | Staples | 1013131 | |
| Rifampicin | Gold Biotechnology | R-120-25 | |
| Silwet L-77 (non-ionic organosilicone surfactant co-polymer C13H34O4Si3 surfactant) | Fisher Scientific | NCO138454 | |
| Tips LTS 20 μL 960/10 GPS-L10 | Rainin | 17005091 | |
| Tips LTS 250 μL 960/10 GPS-L250 | Rainin | 17005093 | |
| VWR dissecting forceps fine tip, 4.5" | VWR International | 82027-386 |
References
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