Identificação de alta duração da resistência a Pseudomonas syringae pv. Tomate no Tomate usando Ensaio de Inundação de Mudas
Summary
O ensaio de inundação de mudas facilita a rápida triagem das adesões de tomate selvagem para a resistência à bactéria Pseudomonas seringae. Este ensaio, usado em conjunto com o ensaio de crescimento bacteriano de mudas, pode auxiliar na caracterização da resistência subjacente à bactéria, e pode ser usado para mapear populações para determinar a base genética da resistência.
Abstract
O tomate é uma cultura agronômica importante que pode ser infectada pela Pseudomonas singae, uma bactéria Gram-negativa, resultando em doenças bacterianas. Otomate-P. sinringae pv. o patosistema de tomate é amplamente utilizado para dissecar a base genética das respostas inatas da planta e da resistência à doença. Embora a doença tenha sido gerida com sucesso por muitas décadas através da introdução do aglomerado genético Pto/PRF de Solanum pimpinellifolium em tomate cultivado, as cepas de raça 1 de P. sinringae evoluíram para superar a resistência conferida pelo grupo genético Pto/PRF e ocorrem em todo o mundo.
As espécies de tomate silvestre são importantes reservatórios de diversidade natural no reconhecimento de patógenos, pois evoluíram em diversos ambientes com diferentes pressões patogênicas. Em telas típicas para resistência a doenças no tomate selvagem, plantas adultas são usadas, o que pode limitar o número de plantas que podem ser rastreadas devido ao seu tempo de crescimento prolongado e maiores exigências de espaço de crescimento. Desenvolvemos um método para testar mudas de tomate de 10 dias de idade para resistência, o que minimiza o tempo de crescimento das plantas e o espaço da câmara de crescimento, permite uma rápida rotatividade de plantas e permite que grandes tamanhos de amostra sejam testados. Os desfechos de sobrevivência ou morte das mudas podem ser tratados como fenótipos discretos ou em uma escala de resistência definida pela quantidade de novo crescimento nas mudas sobreviventes após inundações. Este método foi otimizado para tela de mudas de tomate de 10 dias de idade para resistência a duas cepas p. sinringae e pode ser facilmente adaptado a outras cepas p. syringae.
Introduction
Pseudomonas sinringae é uma bactéria patogênica gram-negativa que infecta uma ampla gama de hospedeiros vegetais. As bactérias entram na planta hospedeira através dos estomatos ou feridas físicas e proliferam no apoplast1. As plantas desenvolveram uma resposta imune de duas camadas para proteger contra infecções por patógenos bacterianos. O primeiro nível ocorre na superfície celular da planta, onde receptores de reconhecimento de padrões na membrana celular vegetal percebem padrões moleculares altamente conservados associados ao patógeno (PAMPs) em um processo chamado imunidade desencadeada por PAMP (PTI)2. Durante esse processo, a planta hospedeira regula as vias de resposta à defesa, incluindo deposição de calose na parede celular, fechamento de estomatas, produção de espécies reativas de oxigênio e indução de genes relacionados à patogênese.
As bactérias podem superar o PTI utilizando um sistema de secreção tipo III para fornecer proteínas, chamadas de efeitos, diretamente na célula vegetal3. As proteínas dos efeitos geralmente visam componentes do PTI e promovem a virulência patogênica4. A segunda camada de imunidade vegetal ocorre dentro da célula vegetal após o reconhecimento das proteínas eficazes. Este reconhecimento depende de genes de resistência, que codificam a repetição de nucleotídeos que contém receptores (NLRs). As NLRs são capazes de reconhecer os efeitos diretamente ou reconhecer sua atividade em um alvo de virulência ou isca5. Eles então desencadeiam uma resposta imune secundária em um processo chamado imunidade desencadeada por efeitos (ETI), que é frequentemente associada a uma resposta hipersensível (HR), uma forma de morte celular localizada no local da infecção6. Em contraste com a resistência gene-for-gene associada ao ETI, as plantas podem apresentar resistência parcial quantitativa, que depende da contribuição de múltiplos genes7.
P. sinringae pv. tomate (Pst) é o agente causal da mancha bacteriana no tomate e é um problema agrícola persistente. As cepas predominantes no campo têm sido tipicamente cepas de raça Pst 0 que expressam ambos os efeitos tipo III AvrPto e AvrPtoB. DC3000 (PstDC3000) é uma cepa representativa de raça 0 e um modelo de patógeno que pode causar manchas bacterianas no tomate. Para combater a doença das manchas bacterianas, os criadores introgressaram o pto [P. singae pv. tomate]/ Prf [Pto resistência e sensibilidade à fenthion] aglomerado da espécie de tomate selvagem Solanum pimpinellifolium em cultivares modernas8,9. O gene Pto codifica uma quinase de proteína serina-threonine que, juntamente com o PRF NLR, confere resistência ao PstDC3000 através do reconhecimento dos efetuantes AvrPto e AvrPtoB10,11,12,13,14. No entanto, essa resistência é ineficaz contra cepas emergentes da raça 1, permitindo sua rápida e agressiva propagação nos últimos anos15,16. As cepas da raça 1 evitam o reconhecimento pelo cluster Pto/PRF, porque a AvrPto está perdida ou mutada nessas cepas, e a AvrPtoB parece acumular minimamente15,17,18.
As populações de tomate silvestre são importantes reservatórios de variação natural para a resistência pst e já foram utilizadas anteriormente para identificar potenciais loci de resistência19,20,21. No entanto, as telas atuais para resistência ao patógeno utilizam plantas adultas de 4 a 5 semanas de idade20,21. Portanto, eles são limitados pelo tempo de crescimento, espaço da câmara de crescimento e tamanhos amostrais relativamente pequenos. Para abordar as limitações das abordagens convencionais, desenvolvemos um ensaio de resistência ao tomate de alto throughput P. sinringae utilizando mudas de tomate de 10 dias de idade22. Esta abordagem oferece várias vantagens sobre o uso de plantas adultas: ou seja, menor tempo de crescimento, requisitos de espaço reduzidos e maior rendimento. Além disso, demonstramos que essa abordagem recapitula fielmente os fenótipos de resistência à doença observados em plantas adultas22.
No ensaio de inundação de mudas descrito neste protocolo, as mudas de tomate são cultivadas em placas de Petri de mídia estéril murashige e skoog (MS) por 10 dias e, em seguida, são inundadas com um inóculo contendo as bactérias de interesse e um surfactante. Após inundações, as mudas podem ser avaliadas quantitativamente para resistência à doença através de ensaios de crescimento bacteriano. Além disso, a sobrevivência ou morte das mudas pode atuar como uma resistência discreta ou fenótipo da doença 7-14 dias após a inundação. Esta abordagem oferece uma alternativa de alto rendimento para a triagem de um grande número de adesões de tomate selvagem para resistência às cepas de raça 1 do Pst, como a cepa Pst T1 (PstT1), e pode ser facilmente adaptada a outras cepas bacterianas de interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um protocolo para inoculação de inundação com PstDC3000 ou PstT1 otimizado para detectar resistência a essas cepas bacterianas em mudas de tomate é descrito. Existem vários parâmetros críticos para os resultados ótimos no ensaio de resistência às mudas, incluindo concentração bacteriana e concentração surfactante, que foram empiricamentedeterminados 22. Para o PstDC3000, a densidade óptica foi otimizada para alcançar a sobrevida completa em uma cultivar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Jamie Calma por testar o efeito do volume de mídia sobre os desfechos de doenças ou resistência. Agradecemos ao Dr. Maël Baudin e ao Dr. Karl J. Scheiber do Laboratório Lewis por fornecerem comentários construtivos e sugestões sobre o manuscrito. A pesquisa sobre imunidade vegetal no laboratório de Lewis foi apoiada pelo USDA ARS 2030-21000-046-00D e 2030-21000-050-00D (JDL), e pela Diretoria de Ciências Biológicas iOS-1557661 (JDL).
Materials
| 3M Tape Micropore 1/2" x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m) | VWR International | 56222-182 | |
| 3mm borosilicate glass beads | Friedrich & Dimmock | GB3000B | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Biophotometer Plus | Eppendorf | E952000006 | |
| Biosafety cabinet, class II type A2 | |||
| BRAND Disposable Plastic Cuvettes, Polystyrene | VWR International | 47744-642 | |
| Chenille Kraft Flat Wood Toothpicks | VWR International | 500029-808 | |
| cycloheximide | Research Products International | C81040-5.0 | |
| Dibasic potassium phosphate anhydrous, ACS grade | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Dimethylformamide | |||
| Dissecting microscope (Magnification of at least 10x) | |||
| Ethanol – 190 Proof | |||
| Falcon polystyrene 96 well microplates, flat-bottom | Fisher Scientific | 08-772-3 | |
| Glass Alcohol Burner Wick | Fisher Scientific | S41898A / No. W-125 | |
| Glass Alcohol Burners | Fisher Scientific | S41898 / No. BO125 | |
| Glycerol ACS reagent | VWR International | EMGX0185-5 | |
| Kimberly-Clark™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Magnesium chloride, ACS grade | VWR International | 97061-356 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, ACS grade | VWR International | 97062-130 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | |||
| Microcentrifuge tubes, 2.2 mL | |||
| Mini Beadbeater-96, 115 volt | Bio Spec Products Inc. | 1001 | |
| Murashige & Skoog, Basal Salts | Caisson Laboratories, Inc. | MSP01-50LT | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL | Rainin | L8-200XLS | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL | Rainin | L8-20XLS | |
| Polystyrene 100mm x 25mm sterile petri dish | VWR International | 89107-632 | |
| Polystyrene 150mm x 15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | FB08-757-14 | |
| Polystyrene 150x15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (defined as 100% bleach) | Staples | 1013131 | |
| Rifampicin | Gold Biotechnology | R-120-25 | |
| Silwet L-77 (non-ionic organosilicone surfactant co-polymer C13H34O4Si3 surfactant) | Fisher Scientific | NCO138454 | |
| Tips LTS 20 μL 960/10 GPS-L10 | Rainin | 17005091 | |
| Tips LTS 250 μL 960/10 GPS-L250 | Rainin | 17005093 | |
| VWR dissecting forceps fine tip, 4.5" | VWR International | 82027-386 |
References
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