Pseudomonas syringae pv Direnci yüksek-Throughput Tanımlama. Fide Sel Asası Kullanarak Domates
Summary
Fide sel testi Pseudomonas syringae bakteridirenç için yabani domates katılımları hızlı tarama kolaylaştırır. Bu tetki, fide bakteri büyüme testi ile birlikte kullanılan, daha fazla bakteriye altta yatan direnç karakterize yardımcı olabilir, ve direnç genetik temelini belirlemek için popülasyonları tarama için kullanılabilir.
Abstract
Domates Pseudomonas syringaetarafından enfekte edilebilir bir tarımsal olarak önemli bir üründür , Bir Gram-negatif bakteri, bakteriyel benek hastalığı ile sonuçlanan. Domates-P. syringae pv. domates patosistemi yaygın bitki doğuştan gelen tepkiler ve hastalık direnci genetik temelini incelemek için kullanılır. Hastalık, Solanum pimpinellifolium’dan Ekili domatese Pto/Prf gen kümesinin getirilmesiyle uzun yıllar boyunca başarılı bir şekilde yönetilirken, P. syringae’nin 1.
Yabani domates türleri patojen tanımada doğal çeşitliliğin önemli rezervuarlarıdır, çünkü farklı patojen basınçları ile farklı ortamlarda evrimleşmişlerdir. Yabani domates hastalık direnci için tipik ekranlarda, yetişkin bitkiler, onların uzun büyüme süresi ve daha fazla büyüme alanı gereksinimleri nedeniyle taranabilir bitki sayısını sınırlayabilir kullanılır. 10 günlük domates fidelerini direnç açısından taramak için bir yöntem geliştirdik, bu yöntem bitki büyüme süresini ve büyüme odası alanını en aza indirir, bitkilerin hızlı bir şekilde devrilmesini sağlar ve büyük numune boyutlarının test edilmesine olanak sağlar. Hayatta kalma veya ölüm fide sonuçları ayrık fenotipler olarak veya sel sonrası kalan fidelerde yeni büyüme miktarı ile tanımlanan bir direnç ölçeğinde tedavi edilebilir. Bu yöntem, 10 günlük domates fidelerini iki P. syringae suşlarına karşı direnç açısından taramak için optimize edilmiştir ve diğer P. syringae suşlarına kolayca adapte edilebilir.
Introduction
Pseudomonas syringae, çok çeşitli bitki konaklarını enfekte eden gram-negatif patojenik bir bakteridir. Bakteriler stomata veya fiziksel yaralar yoluyla konak bitki girin ve apoplast1çoğalır. Bitkiler bakteriyel patojenler tarafından enfeksiyona karşı korumak için iki katmanlı bir bağışıklık yanıtı gelişti. Birinci seviye bitki hücre yüzeyinde oluşur, burada bitki hücre zarında desen tanıma reseptörleri son derece korunmuş patojen ilişkili moleküler desenler algılar (PAMPs) PAMP tetikli bağışıklık denilen bir süreç (PTI)2. Bu işlem sırasında, konak bitki hücre duvarına kalkoz birikimi, stomata kapatılması, reaktif oksijen türlerinin üretimi ve patogenez ile ilgili genlerin indüksiyon dahil olmak üzere savunma tepki yollarını düzenler.
Bakteriler, proteinler olarak adlandırılan proteinleri doğrudan bitki hücresi3’eulaştırmak için tip III salgı sistemini kullanarak PTI’nin üstesinden gelebilirler. Efektör proteinler genellikle PTI bileşenleri hedef ve patojen virülans teşvik4. Bitki bağışıklığının ikinci kademesi, etki alanı proteinlerin tanınması üzerine bitki hücresi içinde oluşur. Bu tanıma direnç genleri bağlıdır, hangi nükleotit bağlayıcı site lösin açısından zengin tekrar içeren reseptörleri (NLR). NLR’ler ya doğrudan efektörleri tanıyabilme ya da bir virülans hedefi ndeki aktivitelerini tanıma ya da5. Daha sonra etkili tetikli bağışıklık denilen bir süreçte ikincil bir bağışıklık yanıtı tetikler (ETI), genellikle aşırı duyarlı bir yanıt ile ilişkili (İK), enfeksiyon yerinde lokalize hücre ölümü bir formu6. ETI ile ilişkili gen-gen direncinin aksine, bitkiler birden fazla genin katkısına bağlı olan kantitatif kısmi dirençgösterebilirler 7.
P. syringae pv. domates (Pst)domates bakteriyel benek nedensel ajan dır ve kalıcı bir tarımsorunudur. Alanında baskın suşları genellikle Pst yarış 0 suşları ya da tip III efektörleri AvrPto ve AvrPtoB her ikisini ifade edilmiştir. DC3000(PstDC3000) temsili bir ırk 0 suşu ve domates bakteriyel leke neden olabilir bir model patojen. Bakteriyel benek hastalığı ile mücadele etmek için, yetiştiriciler Pto introgressed [P. syringae pv. domates]/ Prf [Pto direnci ve fenthion duyarlılık] yabani domates türlerinden gen kümesi Solanum pimpinellifolium içine modern çeşitleri8,9. Pto geni, Prf NLR ile birlikte AvrPto ve AvrPtoB10,11,12,13,14efektörleri tanınması yoluyla PstDC3000 direnç vermek bir serin-threonine protein kimyaz kodlar . Ancak, bu direnç son yıllarda onların hızlı ve agresif yayılması için izin, ortaya çıkan Yarış 1 suşları karşıetkisizdir15,16. AvrPto ya kayıp ya da bu suşları mutasyona uğramış çünkü Yarış 1 suşları, Pto / Prf küme tarafından tanıma kaçınmak, ve AvrPtoB minimal15birikir görünür,17,18.
Yabani domates popülasyonları Pst direnci için doğal varyasyon önemli rezervuarları ve daha önce potansiyel direnç loci belirlemek için kullanılmıştır19,20,21. Ancak, patojen direnci için mevcut ekranlar 4-5 haftalık yetişkin bitkiler20,21kullanır. Bu nedenle, büyüme süresi, büyüme odası alanı ve nispeten küçük örneklem boyutları ile sınırlıdır. Konvansiyonel yaklaşımların sınırlamalarını gidermek için, 10 günlük domates fideleri22kullanarak yüksek iş itimat lı domates P. syringae direnç tayini geliştirdik. Bu yaklaşım yetişkin bitkileri kullanma üzerinde çeşitli avantajlar sunar: yani, daha kısa büyüme süresi, azaltılmış alan gereksinimleri, ve daha yüksek iş artışı. Ayrıca, bu yaklaşımın erişkin bitkilerde gözlenen hastalık direnci fenotipleri sadakatle recapitulates göstermiştir22.
Bu protokolde açıklanan fide sel idamı, steril Murashige ve Skoog (MS) medyasının Petri kaplarında 10 gün boyunca yetiştirilir ve daha sonra ilgi ve yüzey aktif bakterisini içeren bir inokülle dolup taşmaktadır. Sel inden sonra, fideler bakteriyel büyüme tahlilleri ile hastalık direnci açısından nicel olarak değerlendirilebilir. Ayrıca, fide sağkalım veya ölüm sel sonra ayrı bir direnç veya hastalık fenotip 7-14 gün olarak hareket edebilir. Bu yaklaşım, Pst ırkı na karşı direnç için çok sayıda yabani domates katılımlarını tatmak için yüksek iş yapma alternatifi sunar, örneğin Pst suşu T1(PstT1) gibi, ve diğer bakteriyel suşlara kolayca adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Domates fidelerinde bu bakteriyel suşlara karşı direnci tespit etmek için optimize edilen PstDC3000 veya PstT1 ile sel aşısı için bir protokol tanımlanmıştır. Fide direnci tahtında optimum sonuçlar için, ampirik olarak belirlenen bakteri konsantrasyonu ve yüzey aktif konsantrasyonu da dahil olmak üzere çeşitli kritik parametreler vardır22. PstDC3000 için optik yoğunluk, Pto/Prf kümesini içeren dirençli bir çeşitte tam hayatta kalma ve …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz hastalık veya direnç sonuçları üzerinde medya hacminin etkisini test için Jamie Calma teşekkür ederiz. Lewis Lab’dan Dr. Maël Baudin ve Dr. Karl J. Scheiber’a el yazması hakkında yapıcı yorum ve önerilerde bulunduklarından dolayı teşekkür ederiz. Lewis laboratuvarında bitki bağışıklığı üzerine yapılan araştırmalar USDA ARS 2030-21000-046-00D ve 2030-21000-050-00D (JDL) ve NSF Biyolojik Bilimler Müdürlüğü IOS-1557661 (JDL) tarafından desteklendi.
Materials
| 3M Tape Micropore 1/2" x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m) | VWR International | 56222-182 | |
| 3mm borosilicate glass beads | Friedrich & Dimmock | GB3000B | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Biophotometer Plus | Eppendorf | E952000006 | |
| Biosafety cabinet, class II type A2 | |||
| BRAND Disposable Plastic Cuvettes, Polystyrene | VWR International | 47744-642 | |
| Chenille Kraft Flat Wood Toothpicks | VWR International | 500029-808 | |
| cycloheximide | Research Products International | C81040-5.0 | |
| Dibasic potassium phosphate anhydrous, ACS grade | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Dimethylformamide | |||
| Dissecting microscope (Magnification of at least 10x) | |||
| Ethanol – 190 Proof | |||
| Falcon polystyrene 96 well microplates, flat-bottom | Fisher Scientific | 08-772-3 | |
| Glass Alcohol Burner Wick | Fisher Scientific | S41898A / No. W-125 | |
| Glass Alcohol Burners | Fisher Scientific | S41898 / No. BO125 | |
| Glycerol ACS reagent | VWR International | EMGX0185-5 | |
| Kimberly-Clark™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Magnesium chloride, ACS grade | VWR International | 97061-356 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, ACS grade | VWR International | 97062-130 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | |||
| Microcentrifuge tubes, 2.2 mL | |||
| Mini Beadbeater-96, 115 volt | Bio Spec Products Inc. | 1001 | |
| Murashige & Skoog, Basal Salts | Caisson Laboratories, Inc. | MSP01-50LT | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL | Rainin | L8-200XLS | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL | Rainin | L8-20XLS | |
| Polystyrene 100mm x 25mm sterile petri dish | VWR International | 89107-632 | |
| Polystyrene 150mm x 15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | FB08-757-14 | |
| Polystyrene 150x15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (defined as 100% bleach) | Staples | 1013131 | |
| Rifampicin | Gold Biotechnology | R-120-25 | |
| Silwet L-77 (non-ionic organosilicone surfactant co-polymer C13H34O4Si3 surfactant) | Fisher Scientific | NCO138454 | |
| Tips LTS 20 μL 960/10 GPS-L10 | Rainin | 17005091 | |
| Tips LTS 250 μL 960/10 GPS-L250 | Rainin | 17005093 | |
| VWR dissecting forceps fine tip, 4.5" | VWR International | 82027-386 |
References
- Underwood, W., Melotto, M., He, S. Y. Role of plant stomata in bacterial invasion. Cell Microbiology. 9 (7), 1621-1629 (2007).
- Zipfel, C. Early molecular events in PAMP-triggered immunity. Current Opinion in Plant Biology. 12 (4), 414-420 (2009).
- Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
- Lewis, J. D., Desveaux, D., Guttman, D. S. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Seminars in Cell and Developmental Biology. 20 (9), 1055-1063 (2009).
- Schreiber, K. J., Baudin, M., Hassan, J. A., Lewis, J. D. Die another day: molecular mechanisms of effector-triggered immunity elicited by type III secreted effector proteins. Seminars in Cell and Developmental Biology. 56, 124-133 (2016).
- Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Molecular Biology. 44 (3), 321-334 (2000).
- Boyd, L. A., Ridout, C., O’Sullivan, D. M., Leach, J. E., Leung, H. Plant-pathogen interactions: disease resistance in modern agriculture. Trends in Genetics. 29 (4), 233-240 (2013).
- Pitblado, R. E., MacNeill, B. H. Genetic basis of resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato in field tomatoes. Canadian Journal of Plant Pathology. 5 (4), 251-255 (1983).
- Pedley, K. F., Martin, G. B. Molecular basis of Pto-mediated resistance to bacterial speck disease in tomato. Annual Reviews of Phytopathology. 41, 215-243 (2003).
- Ronald, P. C., Salmeron, J. M., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. The cloned avirulence gene AvrPto induces disease resistance in tomato cultivars containing the Pto resistance gene. Journal of Bacteriology. 174 (5), 1604-1611 (1992).
- Martin, G. B., et al. Map-based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistance in tomato. Science. 262 (5138), 1432-1436 (1993).
- Salmeron, J. M., Barker, S. J., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. Tomato mutants altered in bacterial disease resistance provide evidence for a new locus controlling pathogen recognition. Plant Cell. 6 (4), 511-520 (1994).
- Salmeron, J. M., et al. Tomato Prf is a member of the leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes and lies embedded within the Pto kinase gene cluster. Cell. 86 (1), 123-133 (1996).
- Scofield, S. R., et al. Molecular basis of gene-for-gene specificity in bacterial speck disease of tomato. Science. 274 (5295), 2063-2065 (1996).
- Kunkeaw, S., Tan, S., Coaker, G. Molecular and evolutionary analyses of Pseudomonas syringae pv. tomato race 1. Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (4), 415-424 (2010).
- Cai, R., et al. The plant pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato is genetically monomorphic and under strong selection to evade tomato immunity. PLoS Pathogens. 7 (8), 1002130 (2011).
- Almeida, N. F., et al. A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Molecular Plant-Microbe Interactions. 22 (1), 52-62 (2009).
- Lin, N. C., Abramovitch, R. B., Kim, Y. J., Martin, G. B. Diverse AvrPtoB homologs from several Pseudomonas syringae pathovars elicit Pto-dependent resistance and have similar virulence activities. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 702-712 (2006).
- Rose, L. E., Langley, C. H., Bernal, A. J., Michelmore, R. W. Natural variation in the Pto pathogen resistance gene within species of wild tomato (Lycopersicon). I. Functional analysis of Pto alleles. 遗传学. 171 (1), 345-357 (2005).
- Thapa, S. P., Miyao, E. M., Davis, R. M., Coaker, G. Identification of QTLs controlling resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1 strains from the wild tomato Solanum habrochaites LA1777. Theoretical and Applied Genetics. 128 (4), 681-692 (2015).
- Bao, Z. L., et al. Identification of a candidate gene in Solanum habrochaites for resistance to a race 1 strain of Pseudomonas syringae pv. tomato. Plant Genome. 8 (3), 1-15 (2015).
- Hassan, J. A., Zhou, Y. J., Lewis, J. D. A rapid seedling resistance assay identifies wild tomato lines that are resistant to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1. Molecular Plant-Microbe Interactions. 30 (9), 701-709 (2017).
- King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 44 (2), 301-307 (1954).
- Uppalapati, S. R., et al. Pathogenicity of Pseudomonas syringae pv. tomato on tomato seedlings: phenotypic and gene expression analyses of the virulence function of coronatine. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (4), 383-395 (2008).
- Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock. PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).
- Lu, H., McClung, C. R., Zhang, C. Tick tock: circadian regulation of plant innate immunity. Annual Review of Phytopathology. 55, 287-311 (2017).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Nature. 470 (7332), 110-114 (2011).
