Comité de LC-MS/MS validé pour quantifier 11 médicaments antituberculeux pharmacorésistants dans de petits échantillons de cheveux
Summary
Les méthodes actuelles d’analyse de l’adhésion des patients aux régimes complexes de pharmacorésistants-tbsi (DR-TB) peuvent être inexactes et à forte intensité de ressources. Notre méthode analyse les cheveux, une matrice facilement recueillie et stockée, pour des concentrations de 11 médicaments CONTRE la tuberculose DR. À l’aide de LC-MS/MS, nous pouvons déterminer les niveaux de médicaments sous-nanogrammes qui peuvent être utilisés pour mieux comprendre l’observance des médicaments.
Abstract
La tuberculose pharmacorésistante (TBD) est une menace croissante pour la santé publique, et l’évaluation des niveaux de médicaments thérapeutiques peut avoir d’importants avantages cliniques. Les niveaux de médicaments plasmatiques sont l’évaluation actuelle de l’étalon-or, mais nécessitent une phlébotomie et une chaîne de froid, et ne capturent que l’adhérence très récente. Notre méthode utilise les cheveux, une matrice qui est facilement recueillie et réfléchissant à l’adhérence à long terme, pour tester 11 médicaments antituberculeux. Des travaux antérieurs de notre groupe montrent que les niveaux de médicaments antirétroviraux chez les cheveux sont associés aux résultats du VIH. Notre méthode pour les médicaments DR-TB utilise 2 mg de cheveux (3 cm proximal à la racine), qui est pulvérisé et extrait dans le méthanol. Les échantillons sont analysés à l’attention d’une seule méthode LC-MS/MS, quantifiant 11 médicaments dans une course de 16 minutes. Les limites inférieures de quantification (LLOQ) pour les 11 médicaments varient de 0,01 ng/mg à 1 ng/mg. La présence de médicaments est confirmée en comparant les ratios de deux transitions de spectrométrie de masse. Les échantillons sont quantifiés à l’aide du rapport de zone du médicament par rapport à l’isotopologue de drogue détérité, 15N ou 13C-étiqueté. Nous avons utilisé une courbe d’étalonnage allant de 0,001-100 ng/mg. L’application de la méthode à un échantillon de commodité d’échantillons de cheveux prélevés sur des patients atteints de DR-TB sur la thérapie directement observée (DOT) a indiqué des niveaux de médicaments dans les cheveux dans la gamme dynamique linéaire de neuf des onze médicaments (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacine, clofazimine, bédaquiline, prétomanid). Aucun patient n’était sur le prothionamide, et les niveaux mesurés pour l’éthionamide étaient proches de son LLOQ (avec d’autres travaux examinant plutôt la pertinence du métabolite d’éthionamide pour surveiller l’exposition). En résumé, nous décrivons le développement d’un panel multi-analyte pour les médicaments DR-TB dans les cheveux comme une technique de surveillance thérapeutique des médicaments pendant le traitement pharmacorésistant de la tuberculose.
Introduction
Au XXIe siècle, la tuberculose pharmacorésistante (TB-DR) est une catastrophe en évolution pour les programmes nationaux de lutte contre la tuberculose déjà faibles, avec des cas confirmés qui ont doublé au cours des cinq dernières années seulement, représentant près d’un tiers de tous les décès liés à la résistance aux antimicrobiens dans le monde1,2. Le traitement réussi de la TUBERCULOSE DR a traditionnellement exigé des régimes de deuxième intention plus longs et plus toxiques que le traitement de la tuberculose sensible à la drogue. En outre, les patients atteints de DR-TB ont souvent des défis préexistants importants à l’adhésion, qui a contribué à l’émergence de la résistance initialement3.
Contrairement à l’infection par le VIH où les charges virales peuvent être utilisées pour surveiller le traitement, les critères de substitution de la réponse au traitement dans la tuberculose sont retardés et peu fiables au niveau individuel4. La surveillance de l’observance des patients, un prédicteur important de la concentration et de l’échec du traitement antituberculeux sous-thérapeutiques, est également difficile. L’adhésion auto-déclarée souffre de biais de rappel et le désir de s’il vous plaît fournisseurs5,6. Le nombre de pilules et les systèmes de surveillance des événements médicamenteux (MEMS) peuvent être plusobjectifs 7, mais ne mesurent pas la consommation réelle de drogues8,9,10. Les niveaux de médicaments dans les biomatrices peuvent fournir des données d’observance et pharmacocinétiques. Par conséquent, les niveaux de médicaments plasmatiques sont couramment utilisés dans la surveillance des médicaments thérapeutiques11,12. Dans le contexte de la surveillance de l’adhérence des médicaments, cependant, les niveaux de plasma représentent une exposition à court terme et sont limités par une variabilité intra- et interpériabilité importante des patients lorsqu’ils déterminent la plage de référence appropriée de l’observance. Les effets du « manteau blanc », où l’observance s’améliore avant les visites à la clinique ou à l’étude, compliquent encore davantage la capacité des niveaux plasmatiques à fournir des modèles précis d’adhérence des médicaments13.
Hair est un biomatrix alternatif qui peut mesurer l’exposition à long terme de drogue14,15. Beaucoup de médicaments et de métabolites endogènes incorporent dans la matrice de protéine de cheveux de la circulation systémique pendant que les cheveux grandissent. Comme ce processus dynamique continue pendant la croissance des cheveux, la quantité de médicament déposé dans la matrice de cheveux dépend de la présence continue de la drogue en circulation, ce qui rend les cheveux une excellente lecture temporelle de la prise de médicaments. Les cheveux en tant que biomatrix ont l’avantage supplémentaire d’être facilement collectés sans avoir besoin de chaîne de froid pour le stockage et l’expédition par rapport au sang. En outre, les cheveux sont non-biorisqueux, ce qui offre des avantages de faisabilité supplémentaires dans le domaine.
Les niveaux de médicaments capillaires ont longtemps été utilisés dans les applications médico-légales16. Au cours de la dernière décennie, les niveaux d’antirétroviraux capillaires (ARV) ont démontré leur utilité dans l’évaluation de l’observance des médicaments dans le traitement et la prévention du VIH, auxquels notre groupe a contribué. Les niveaux d’ARV dans les cheveux se sont avérés être les plus forts prédicteurs indépendants des résultats de traitement dans l’infection de VIH17,18,19,20,21. Pour déterminer si les niveaux de cheveux des patients atteints de tuberculose DR auront le même utilité à prédire les résultats du traitement, nous avons utilisé la LC-MS/MS pour mettre au point et valider une méthode d’analyse de 11 médicaments antituberculeux dans de petits échantillons de cheveux. Dans le cadre d’une évaluation initiale de la performance de l’analyse, nous avons mesuré les niveaux de médicaments antituberculeux dr dans un échantillon pratique de patients atteints de TUBERCULOSE DR recevant un traitement directement observé (DOT) au Cap-Occidental, Afrique du Sud22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous rapportons ici le protocole pour la méthode que nous avons développée et validée pour quantifier 11 médicaments antituberculeux utilisés dans le traitement de la TUBERCULOSE DR dans de petits échantillons de cheveux à l’aide de LC-MS/MS. Aucune autre méthode pour quantifier ces 11 médicaments dans les cheveux n’a été précédemment développée, validée et publiée. Notre méthode peut quantifier les niveaux de sous-nanogrammes de médicaments dans seulement 20-30 mèches de cheveux d’environ 3 ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tient à remercier le professeur Keertan Dheda, le Dr Ali Esmail et Marietjie Pretorius de l’Institut pulmonaire de l’Université du Cap qui ont facilité la collecte d’échantillons de cheveux pour l’étude. Les auteurs reconnaissent également avec gratitude les contributions des participants à cette étude.
Materials
| 2 mL injection vials | Agilent Technologies | 5182-0716 | |
| 250 uL injection vial inserts | Agilent Technologies | 5181-8872 | |
| Bead ruptor 24 | OMNI International | 19001 | |
| Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) | OMNI International | 19628 | |
| Bedaquiline | Toronto Research Chemicals | B119550 | |
| Bedaquiline-d6 | Toronto Research Chemicals | B119552 | |
| Clofazimine | Toronto Research Chemicals | C324300 | |
| Clofazimine-d7 | Toronto Research Chemicals | C324302 | |
| Disposable lime glass culture tubes | VWR | 60825-425 | |
| Ethambutol | Toronto Research Chemicals | E889800 | |
| Ethambutol-d4 | Toronto Research Chemicals | E889802 | |
| Ethionamide | Toronto Research Chemicals | E890420 | |
| Ethionamide-d5 | ClearSynth | CS-O-06597 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507-100mL | |
| Glass bottles | Corning | 1395-1L | |
| Hot Shaker | Bellco Glass Inc | 7746-32110 | |
| HPLC | Agilent Technologies | Infinity 1260 | |
| HPLC grade acetonitrile | Honeywell | 015-4 | |
| HPLC grade methanol | Honeywell | 230-1L | |
| HPLC grade water | Aqua Solutions Inc | W1089-4L | |
| Isoniazid | Toronto Research Chemicals | I821450 | |
| Isoniazid-d4 | Toronto Research Chemicals | I821452 | |
| LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm | Phenomenex | 00D-4371-B0 | |
| LC guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8788 | |
| LC guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | |
| LC-MS/MS quantitation software | Sciex | Multiquant 2.1 | |
| Levofloxacin | Sigma-Aldrich | 1362103-200MG | |
| Levofloxacin-d8 | Toronto Research Chemicals | L360002 | |
| Linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| Linezolid-d3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | |
| Micro centrifuge tubes | E&K Scientific | 695554 | |
| Moxifloxacin | Toronto Research Chemicals | M745000 | |
| Moxifloxacin-13C, d3 | Toronto Research Chemicals | M745003 | |
| MS/MS | Sciex | Triple Quad 5500 | |
| OPC 14714 | Toronto Research Chemicals | O667600 | |
| Pretomanid (PA-824) | Toronto Research Chemicals | P122500 | |
| Prothionamide | Toronto Research Chemicals | P839100 | |
| Prothionamide-d5 | Toronto Research Chemicals | P839102 | |
| Pyrazinamide | Toronto Research Chemicals | P840600 | |
| Pyrazinamide-15N, d3 | Toronto Research Chemicals | P840602 | |
| Septum caps for injection vials | Agilent Technologies | 5185-5862 | |
| Turbovap LV evaporator | Biotage | 103198/11 |
References
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