Painel LC-MS/MS validado para quantificar 11 medicamentos resistentes a medicamentos para tuberculose em amostras de cabelos pequenos
Summary
Os métodos atuais de análise da adesão dos pacientes a regimes complexos de tuberculose resistente a medicamentos (DR-TB) podem ser imprecisos e intensivos em recursos. Nosso método analisa o cabelo, uma matriz facilmente coletada e armazenada, para concentrações de 11 medicamentos DR-TB. Usando LC-MS/MS, podemos determinar níveis de drogas de sub-nanogramas que podem ser utilizados para entender melhor a adesão aos medicamentos.
Abstract
A tuberculose resistente a medicamentos (DR-TB) é uma ameaça crescente à saúde pública, e a avaliação dos níveis de medicamentos terapêuticos pode ter importantes benefícios clínicos. Os níveis de drogas plasmáticas são a avaliação padrão-ouro atual, mas requerem flebotomia e uma cadeia fria, e capturam apenas a adesão muito recente. Nosso método utiliza o cabelo, uma matriz que é facilmente coletada e reflexo da adesão a longo prazo, para testar 11 medicamentos anti-TB. Trabalhos anteriores do nosso grupo mostram que os níveis de drogas antirretrovirais nos cabelos estão associados aos desfechos do HIV. Nosso método para drogas DR-TB utiliza 2 mg de cabelo (3 cm proximal à raiz), que é pulverizado e extraído em metanol. As amostras são analisadas com um único método LC-MS/MS, quantificando 11 medicamentos em um período de 16 minutos. Os limites mais baixos de quantificação (LLOQs) para os 11 fármacos variam de 0,01 ng/mg a 1 ng/mg. A presença de drogas é confirmada comparando-se as razões de duas transições de espectrometria de massa. As amostras são quantificadas usando a proporção da droga para o iotopologue de droga denominado, 15N-, ou 13C-labeled. Utilizou-se uma curva de calibração variando de 0,001-100 ng/mg. A aplicação do método a uma amostra de conveniência de amostras de cabelo coletadas de pacientes com DR-TB em terapia diretamente observada (DOT) indicou níveis de fármacos no cabelo dentro da faixa dinâmica linear de nove das onze drogas (isoniazida, pirazinamida, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimina, bedaquiline, pretomanid). Nenhum paciente estava em prothionamida, e os níveis medidos de ethionamida estavam próximos de seu LLOQ (com trabalho suplementar, examinando a adequação do metabólito da ethionamida para a exposição ao monitoramento). Em resumo, descrevemos o desenvolvimento de um painel multi-anilte para medicamentos DR-TB no cabelo como uma técnica de monitoramento de drogas terapêuticas durante o tratamento de TB resistente a medicamentos.
Introduction
No século XXI, a TB resistente a medicamentos (DR-TB) é uma catástrofe em evolução para programas de controle nacional de TB já fracos, com casos confirmados dobrando apenas nos últimos 5 anos, representando quase um terço de todas as mortes relacionadas à resistência antimicrobiana globalmente1,2. O tratamento bem-sucedido da TB-DR tem exigido convencionalmente regimes de segunda linha mais longos e tóxicos do que o tratamento para a TB sensível a medicamentos. Além disso, os pacientes com TB-DR frequentemente têm desafios pré-existentes significativos para a adesão, o que contribuiu para o surgimento da resistência inicialmente3.
Ao contrário da infecção pelo HIV, onde as cargas virais podem ser usadas para monitorar o tratamento, os pontos finais substitutos da resposta ao tratamento em TB são atrasados e não são confiáveis em um nível individual4. O monitoramento da adesão do paciente, um importante preditor da concentração de medicamentos anti-TB subterapêuticos e falha no tratamento, também é desafiador. A adesão autorreferida sofre de viés de recall e o desejo de agradar aos provedores5,6. A contagem de comprimidos e os sistemas de monitoramento de eventos medicamentosos (MEMS) podem ser mais objetivos7, mas não medem o consumo real de drogas8,,9,10. Os níveis de medicamentos em biomatrices podem fornecer dados de adesão e farmacocinética. Portanto, os níveis de fárres plasmáticos são comumente utilizados no monitoramento de drogas terapêuticas11,12. No contexto do monitoramento da adesão a medicamentos, no entanto, os níveis plasmáticos representam exposição a curto prazo e são limitados por significativa variabilidade intra e interpaciente ao determinar a faixa de referência de adesão adequada. Os efeitos do “jaleco branco”, onde a adesão melhora antes das visitas clínicas ou de estudo, complicam ainda mais a capacidade dos níveis plasmáticos de fornecer padrões precisos de adesão a medicamentos13.
O cabelo é uma biomatriz alternativa que pode medir a exposição a medicamentos a longo prazo14,15. Muitas drogas e metabólitos endógenos incorporam-se à matriz proteica capilar da circulação sistêmica à medida que o cabelo cresce. Como esse processo dinâmico continua durante o crescimento capilar, a quantidade de droga depositada na matriz capilar depende da presença contínua da droga em circulação, tornando o cabelo uma excelente leitura temporal da ingestão de drogas. O cabelo como biomatriz tem a vantagem adicional de ser facilmente coletado sem a necessidade de cadeia fria para armazenamento e expedição em comparação com o sangue. Além disso, o cabelo não é bioperigoso, o que proporciona vantagens adicionais de viabilidade no campo.
Os níveis de drogas capilares têm sido usados há muito tempo em aplicações forenses16. Na última década, os níveis de antirretroviral capilar (ARV) demonstraram utilidade na avaliação da adesão de medicamentos no tratamento e prevenção do HIV, para os quais nosso grupo contribuiu. Os níveis de ARV nos cabelos têm se mostrado os mais fortes preditores independentes dos desfechos de tratamento na infecção pelo HIV17,18,19,20,21. Para determinar se os níveis de cabelo dos pacientes com TB-DR terão a mesma utilidade na previsão do resultado do tratamento, utilizou-se o LC-MS/MS para desenvolver e validar um método para analisar 11 medicamentos DR-TB em pequenas amostras de cabelo. Como avaliação inicial do desempenho do ensaio, medimos os níveis de medicamentos DR-TB em uma amostra de conveniência de pacientes com TB-DR recebendo terapia observada diretamente (DOT) no Cabo Ocidental, África do Sul22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Relatamos aqui o protocolo para o método que desenvolvemos e validamos para quantificar 11 medicamentos anti-TB utilizados no tratamento de DR-TB em pequenas amostras de cabelo utilizando LC-MS/MS. Nenhum outro método para quantificar essas 11 drogas em cabelos foi previamente desenvolvido, validado e publicado. Nosso método pode quantificar os níveis de sub-nanogramas de drogas em apenas 20-30 fios de cabelo de aproximadamente 3 centímetros (cm) de comprimento (~2 mg) e já foi validado22. O…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao professor Keertan Dheda, ao Dr. Ali Esmail e a Marietjie Pretorius, do Instituto de Pulmão da Universidade da Cidade do Cabo, que facilitaram a coleta de amostras de cabelo para o estudo. Os autores reconhecem ainda com gratidão as contribuições dos participantes deste estudo.
Materials
| 2 mL injection vials | Agilent Technologies | 5182-0716 | |
| 250 uL injection vial inserts | Agilent Technologies | 5181-8872 | |
| Bead ruptor 24 | OMNI International | 19001 | |
| Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) | OMNI International | 19628 | |
| Bedaquiline | Toronto Research Chemicals | B119550 | |
| Bedaquiline-d6 | Toronto Research Chemicals | B119552 | |
| Clofazimine | Toronto Research Chemicals | C324300 | |
| Clofazimine-d7 | Toronto Research Chemicals | C324302 | |
| Disposable lime glass culture tubes | VWR | 60825-425 | |
| Ethambutol | Toronto Research Chemicals | E889800 | |
| Ethambutol-d4 | Toronto Research Chemicals | E889802 | |
| Ethionamide | Toronto Research Chemicals | E890420 | |
| Ethionamide-d5 | ClearSynth | CS-O-06597 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507-100mL | |
| Glass bottles | Corning | 1395-1L | |
| Hot Shaker | Bellco Glass Inc | 7746-32110 | |
| HPLC | Agilent Technologies | Infinity 1260 | |
| HPLC grade acetonitrile | Honeywell | 015-4 | |
| HPLC grade methanol | Honeywell | 230-1L | |
| HPLC grade water | Aqua Solutions Inc | W1089-4L | |
| Isoniazid | Toronto Research Chemicals | I821450 | |
| Isoniazid-d4 | Toronto Research Chemicals | I821452 | |
| LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm | Phenomenex | 00D-4371-B0 | |
| LC guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8788 | |
| LC guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | |
| LC-MS/MS quantitation software | Sciex | Multiquant 2.1 | |
| Levofloxacin | Sigma-Aldrich | 1362103-200MG | |
| Levofloxacin-d8 | Toronto Research Chemicals | L360002 | |
| Linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| Linezolid-d3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | |
| Micro centrifuge tubes | E&K Scientific | 695554 | |
| Moxifloxacin | Toronto Research Chemicals | M745000 | |
| Moxifloxacin-13C, d3 | Toronto Research Chemicals | M745003 | |
| MS/MS | Sciex | Triple Quad 5500 | |
| OPC 14714 | Toronto Research Chemicals | O667600 | |
| Pretomanid (PA-824) | Toronto Research Chemicals | P122500 | |
| Prothionamide | Toronto Research Chemicals | P839100 | |
| Prothionamide-d5 | Toronto Research Chemicals | P839102 | |
| Pyrazinamide | Toronto Research Chemicals | P840600 | |
| Pyrazinamide-15N, d3 | Toronto Research Chemicals | P840602 | |
| Septum caps for injection vials | Agilent Technologies | 5185-5862 | |
| Turbovap LV evaporator | Biotage | 103198/11 |
References
- Kurbatova, E. V., et al. Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects. Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).
- Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Respiratory Medicine. , (2017).
- Berg, K. M., Arnsten, J. H. Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence. Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, 79-87 (2006).
- Kagee, A., Nel, A. Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures. AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).
- Haberer, J. E., et al. Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa. PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).
- Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. Time to stop counting the tablets. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).
- Liu, H., et al. A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors. Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).
- Wendel, C., et al. Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic. Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).
- Ruiz, J., et al. Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients. Clinical Pharmacology & Therapeutic. , (2019).
- Saktiawati, A. M., et al. Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis. Clinical Phamacokinetics. , (2019).
- Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. “White coat compliance” limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients. HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).
- Cuypers, E., Flanagan, R. J. The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites. Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).
- Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. Hair analysis for drug detection. Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).
- Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology. Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).
- Gandhi, M., et al. Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy. Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).
- Koss, C. A., et al. Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women. AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).
- Pintye, J., et al. Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).
- Baxi, S. M., et al. Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients. PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).
- Gandhi, M., et al. Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial. Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).
- Gerona, R., et al. Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel. Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).
- Metcalfe, J., et al. Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB. European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).
- Metcalfe, J. Z., O’Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis. PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).
