Проверенная lc-MS/MS Panel для количественной оценки 11 лекарствоустойчивых противотуберкулезных препаратов в малых образцах волос
Summary
Современные методы анализа приверженности пациентов сложным режимам лекарственно-туберкулезного (ДР-ТБ) могут быть неточными и ресурсоемкими. Наш метод анализирует волосы, легко собранную и хранящуюся матрицу, на концентрации 11 препаратов DR-TB. Используя LC-MS/MS, мы можем определить уровни субнанограммы наркотиков, которые могут быть использованы, чтобы лучше понять соблюдение препарата.
Abstract
Лекарственно-туберкулезный (ДР-ТБ) представляет собой растущую угрозу для общественного здравоохранения, и оценка уровней терапевтических препаратов может иметь важные клинические преимущества. Уровни плазменных препаратов являются текущей оценки золотого стандарта, но требуют флеботомии и холодной цепи, и захватить только совсем недавнее соблюдение. Наш метод использует волосы, матрицу, которая легко собирается и отражает долгосрочное соблюдение, для тестирования на 11 противотуберкулезных препаратов. Предыдущая работа нашей группы показывает, что уровень антиретровирусных препаратов в волосах связан с исходами ВИЧ. Наш метод лечения препаратов Д-БД-ТБ использует 2 мг волос (3 см, проксимальных к корню), которые измельчаются и извлекаются в метанол. Образцы анализируются с помощью одного метода LC-MS/MS, количественно опрометив111 препаратов за 16 мин. Более низкие пределы количественной оценки (ЛЛО) для 11 препаратов варьируются от 0,01 нг/мг до 1 нг/мг. Присутствие препарата подтверждается сравнением соотношений двух переходов масс-спектрометрии. Образцы количественно с использованием области соотношение препарата к deuterated, 15N-, или 13C-помечены наркотиков изотополог. Мы использовали кривую калибровки в диапазоне от 0,001-100 нг/мг. Применение метода к удобному образцу образцов волос, собранных у пациентов с ДБ-ТБ при непосредственно наблюдаемой терапии (ДОТ), показало уровень препарата в волосах в линейном динамическом диапазоне девяти из одиннадцати препаратов (изониазид, пиразинамид, этамбутол, линезолид, левофлоксацин, моксифоксикацин, клоназимин, лобэк, претоманид). Ни один пациент не был на протионамид, и измеренные уровни для этионамид были близки к его LLO (с дальнейшей работой вместо изучения пригодности метаболита этионамид для мониторинга воздействия). Подводя итог, мы описываем разработку мульти-аналитовой панели для препаратов д-р-ТБ в волосах как метод терапевтического мониторинга лекарственных средств во время лечения лекарственно-устойчивого ТБ.
Introduction
В XXI веке лекарственно-устойчивый ТБ (ДР-ТБ) является развивающейся катастрофой для и без того слабых национальных программ борьбы с туберкулезом, причем только за последние 5 лет число подтвержденных случаев заболевания удвоилось, что составляет почти треть всех случаев смерти, связанных с устойчивостью к противомикробным препаратам во всем мире1,2. Успешное лечение Д-ТБ обычно требует более длительных и более токсичных схем второй линии, чем лечение тБ, чувствительного к наркотикам. Кроме того, пациенты с DR-ТБ часто имеют значительные ранее существовавшие проблемы с соблюдением, что способствовало появлению резистентности первоначально3.
В отличие от ВИЧ-инфекции, где вирусные нагрузки могут быть использованы для мониторинга лечения, суррогатные конечные точки лечения при ТБ задерживаются и ненадежны на индивидуальном уровне4. Мониторинг приверженности пациента, важный предиктор субтерапевтической концентрации противотуберкулезных препаратов и неудачи лечения, также является сложной задачей. Самостоятельно сообщил и совпадение соблюдения страдает от отзыва предвзятости и желание угодить поставщикам5,6. Таблетки рассчитывает и лекарства системы мониторинга событий (MEMS) может быть более объективным7, но не измеряют фактическое потребление наркотиков8,9,10. Уровни лекарственных средств в биоматрисах могут обеспечить как присоединение, так и фармакокинетические данные. Таким образом, уровни плазмы наркотиков обычно используются в терапевтических мониторинга наркотиков11,12. Однако в контексте мониторинга соблюдения лекарственных средств уровни плазмы представляют собой кратковременное воздействие и ограничены значительной внутри- и межпациентной изменчивостью при определении соответствующего диапазона ссылки на присоединение. Эффекты “белого пальто”, когда присоединение улучшается до посещения клиники или исследования, еще больше осложняет способность уровней плазмы обеспечивать точные модели пристыковки препарата13.
Волосы является альтернативной биоматрицы, которые могут измерять долгосрочное воздействие наркотиков14,15. Многие препараты и эндогенные метаболиты включаются в матрицу белка волос из системного кровообращения по мере роста волос. Поскольку этот динамичный процесс продолжается во время роста волос, количество препарата, отложенного в матрице волос, зависит от непрерывного присутствия препарата в обращении, что делает волосы отличным временным считыванием препарата. Волосы как биоматрицы имеет дополнительное преимущество легко собираться без необходимости холодной цепи для хранения и отгрузки по сравнению с кровью. Кроме того, волосы не являются биоопасными, что обеспечивает дополнительные преимущества осуществимости в этой области.
Уровни волос наркотиков уже давно используются в судебно-медицинской экспертизы16. За последнее десятилетие уровни антиретровирусной (АРВ) волос продемонстрировали полезность в оценке приверженности препаратам в лечении и профилактике ВИЧ, в которые внесла вклад наша группа. Уровни АРВ волос оказались самыми сильными независимыми предикторами исходов лечения при ВИЧ-инфекции17,,18,,19,,20,,21. Чтобы определить, будут ли уровень волос больных Д-БД-ТБ иметь такую же полезность в прогнозировании результатов лечения, мы использовали LC-MS/MS для разработки и проверки метода анализа 11 препаратов DR-TB в небольших образцах волос. В качестве первоначальной оценки эффективности анализ, мы измерили уровни DR-TB наркотиков в удобной выборке пациентов с DR-TB, получающих непосредственно наблюдаемую терапию (DOT) в Западной Капской провинции, южная Африка22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы сообщаем здесь протокол для метода мы разработали и подтвердили для количественной оценки 11 противотуберкулезных препаратов, используемых в лечении DR-Tb в небольших образцах волос с помощью LC-MS/MS. Ни один другой метод количественной оценки этих 11 препаратов в волосах не был ранее раз…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить профессора Кертана Дхеды, д-ра Али Эсмаила и Мариетджи Преториус из Института легких Кейптаунского университета, которые способствовали сбору образцов волос для исследования. Авторы также с благодарностью признают вклад участников этого исследования.
Materials
| 2 mL injection vials | Agilent Technologies | 5182-0716 | |
| 250 uL injection vial inserts | Agilent Technologies | 5181-8872 | |
| Bead ruptor 24 | OMNI International | 19001 | |
| Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) | OMNI International | 19628 | |
| Bedaquiline | Toronto Research Chemicals | B119550 | |
| Bedaquiline-d6 | Toronto Research Chemicals | B119552 | |
| Clofazimine | Toronto Research Chemicals | C324300 | |
| Clofazimine-d7 | Toronto Research Chemicals | C324302 | |
| Disposable lime glass culture tubes | VWR | 60825-425 | |
| Ethambutol | Toronto Research Chemicals | E889800 | |
| Ethambutol-d4 | Toronto Research Chemicals | E889802 | |
| Ethionamide | Toronto Research Chemicals | E890420 | |
| Ethionamide-d5 | ClearSynth | CS-O-06597 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507-100mL | |
| Glass bottles | Corning | 1395-1L | |
| Hot Shaker | Bellco Glass Inc | 7746-32110 | |
| HPLC | Agilent Technologies | Infinity 1260 | |
| HPLC grade acetonitrile | Honeywell | 015-4 | |
| HPLC grade methanol | Honeywell | 230-1L | |
| HPLC grade water | Aqua Solutions Inc | W1089-4L | |
| Isoniazid | Toronto Research Chemicals | I821450 | |
| Isoniazid-d4 | Toronto Research Chemicals | I821452 | |
| LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm | Phenomenex | 00D-4371-B0 | |
| LC guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8788 | |
| LC guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | |
| LC-MS/MS quantitation software | Sciex | Multiquant 2.1 | |
| Levofloxacin | Sigma-Aldrich | 1362103-200MG | |
| Levofloxacin-d8 | Toronto Research Chemicals | L360002 | |
| Linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| Linezolid-d3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | |
| Micro centrifuge tubes | E&K Scientific | 695554 | |
| Moxifloxacin | Toronto Research Chemicals | M745000 | |
| Moxifloxacin-13C, d3 | Toronto Research Chemicals | M745003 | |
| MS/MS | Sciex | Triple Quad 5500 | |
| OPC 14714 | Toronto Research Chemicals | O667600 | |
| Pretomanid (PA-824) | Toronto Research Chemicals | P122500 | |
| Prothionamide | Toronto Research Chemicals | P839100 | |
| Prothionamide-d5 | Toronto Research Chemicals | P839102 | |
| Pyrazinamide | Toronto Research Chemicals | P840600 | |
| Pyrazinamide-15N, d3 | Toronto Research Chemicals | P840602 | |
| Septum caps for injection vials | Agilent Technologies | 5185-5862 | |
| Turbovap LV evaporator | Biotage | 103198/11 |
References
- Kurbatova, E. V., et al. Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects. Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).
- Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Respiratory Medicine. , (2017).
- Berg, K. M., Arnsten, J. H. Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence. Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, 79-87 (2006).
- Kagee, A., Nel, A. Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures. AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).
- Haberer, J. E., et al. Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa. PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).
- Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. Time to stop counting the tablets. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).
- Liu, H., et al. A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors. Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).
- Wendel, C., et al. Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic. Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).
- Ruiz, J., et al. Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients. Clinical Pharmacology & Therapeutic. , (2019).
- Saktiawati, A. M., et al. Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis. Clinical Phamacokinetics. , (2019).
- Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. “White coat compliance” limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients. HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).
- Cuypers, E., Flanagan, R. J. The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites. Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).
- Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. Hair analysis for drug detection. Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).
- Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology. Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).
- Gandhi, M., et al. Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy. Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).
- Koss, C. A., et al. Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women. AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).
- Pintye, J., et al. Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).
- Baxi, S. M., et al. Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients. PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).
- Gandhi, M., et al. Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial. Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).
- Gerona, R., et al. Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel. Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).
- Metcalfe, J., et al. Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB. European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).
- Metcalfe, J. Z., O’Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis. PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).
