מאומת LC-MS/MS הפאנל לכמת 11 תרופות עמידות לפני שחפת בדגימות שיער קטן
Summary
שיטות נוכחיות של ניתוח הדבקות של המטופלים בטיפול תרופתי מורכב-שחפת (DR-TB) משטרי יכול להיות לא מדויק ואינטנסיבי משאבים. השיטה שלנו מנתחת שיער, מטריצה בקלות שנאסף ומאוחסן, עבור ריכוזי של 11 תרופות DR-TB. באמצעות LC-MS/MS, אנחנו יכולים לקבוע את רמות התרופות תת-ננוגרמה שניתן לנצל כדי להבין טוב יותר את הדבקות בסמים.
Abstract
עמיד בפני סמים-שחפת (DR-TB) הוא איום בריאות הציבור הולך וגדל, והערכה של רמות תרופות טיפוליות אולי הטבות קליניות חשוב. רמות התרופה פלזמה הם הערכה התקן הזהב הנוכחי, אבל דורשים כריתת-פלבוטומיה ושרשרת קרה, וללכוד רק לאחרונה הדבקות. השיטה שלנו משתמשת שיער, מטריצה כי הוא נאסף בקלות רפלקטיבית של הדבקות לטווח ארוך, כדי לבדוק 11 נגד שחפת תרופות. העבודה הקודמת של הקבוצה שלנו מראה כי רמות התרופה תרופתי בשיער קשורים לתוצאות HIV. השיטה שלנו לתרופות DR-TB משתמשת 2 מ”ג של שיער (3 ס מ האבותיים לשורש), אשר מרוסק ומופק ב מתנול. דגימות מנותח עם שיטת LC-MS/MS יחידה, כימות 11 תרופות ב 16 דקות לרוץ. המגבלות הנמוכות יותר של כימות (יוסה) עבור 11 התרופות נעות בין 0.01 ng/mg ל-1 ng/mg. נוכחות התרופה מאושרת על ידי השוואת היחס בין שני מעברים בעלי ספקטרומטר מסה. דגימות הן כימות באמצעות יחס האזור של התרופה הדאובטים, 15N-, או 13C התווית איזוטופולוג התרופה. השתמשנו עקומת כיול החל מ-0.001-100 ng/mg. יישום השיטה למדגם נוחות של דגימות שיער שנאספו מחולים DR-TB על טיפול ישירות נצפתה (DOT) המצוין רמות הסמים בשיער בתוך טווח דינמי ליניארי של תשעה התרופות 11 (isoniazid,, מlevofloxacin, מmoxifloxacin, קלופצין. בדקווינין, פרטואיד (מחלקה) החולה לא היה על prothionamide, ואת רמות נמדד עבור ethionamide היו קרובים ל-יוסה שלה (עם עבודה נוספת במקום לבחון את ההתאמה של המטאווליט של ethionamide לניטור החשיפה). לסיכום, אנו מתארים את ההתפתחות של פאנל רב תכליתי עבור תרופות DR-TB בשיער כטכניקה עבור ניטור התרופה הטיפולית במהלך טיפול עמיד בפני תרופות נגד שחפת.
Introduction
במאה העשרים ואחת, עמיד בפני תרופות tb (ד ר-TB) הוא אסון מתפתח עבור תוכניות שליטה הלאומי חלש כבר שחפת, עם המקרים אישר הכפלת בעבר 5 שנים בלבד, חשבונאות כמעט שליש ממקרי המוות הקשורים להתנגדות מיקרוביאלית גלובלית1,2. הטיפול המוצלח של DR-TB נדרש בדרך הנדרשת יותר ויותר רעיל קו השני משטרי מאשר טיפול עבור התרופה רגיש TB. יתר על כן, חולים עם DR-TB לעתים קרובות יש אתגרים משמעותיים מראש קיימים לדבקות, אשר תרמו הופעתה של התנגדות בתחילה3.
בניגוד לזיהום HIV שבו נטען ויראלי ניתן להשתמש כדי לפקח על הטיפול, נקודות קצה פונדקאית של תגובת הטיפול בשחפת מתעכב ולא אמין על רמה הפרט4. מעקב הקפדה על המטופל, מנבא חשוב של ריכוז תרופות נגד שחפת וכישלון הטיפול, הוא גם מאתגר. הדבקות מדווחת בעצמו סובלת מאחזור הטיה והרצון לספק את הספקים5,6. ספירות הגלולה ותרופות מערכות ניטור אירועים (mems) יכול להיות אובייקטיבי יותר7 אך לא למדוד את צריכת התרופה בפועל8,9,10. רמות התרופות ב-ביואטריסס יכולות לספק גם נתונים הניתנים לדבקות ולשני הפרמקוקינטיים. לכן, רמות התרופות פלזמה משמשות בדרך כלל בניטור תרופות טיפולית11,12. עם זאת, בהקשר של ניטור הדבקות בסמים, רמות הפלזמה מייצגות חשיפה לטווח קצר ומוגבלות על-ידי שינויים משמעותיים בפנים ובבין המטופלים בעת קביעת טווח התייחסות מתאים לדבקות. אפקטים של “מעיל לבן”, כאשר הדבקות משתפרת לפני ביקורי מרפאה או לימודים, מסבך עוד יותר את יכולתם של רמות פלזמה לספק דפוסי הדבקות בסמים מדויקים13.
שיער הוא ביומטריקס אלטרנטיבי שיכול למדוד לטווח ארוך14חשיפהלסמים 14,15. תרופות רבות חילוף החומרים האנדוגניים לשלב לתוך מטריצת חלבון השיער מן המחזור מערכתית כמו שיער צומח. כאשר תהליך דינמי זה נמשך במהלך צמיחת השיער, כמות התרופה שהופקדו במטריקס שיער תלוי בנוכחות רציפה של התרופה במחזור, הפיכת שיער בדיקה טמפורלית מעולה של צריכת התרופה. שיער כמו ביומטריקס יתרון נוסף של להיות נאסף בקלות ללא צורך שרשרת קר לאחסון ומשלוח בהשוואה לדם. כמו-כן, השיער אינו ביולוגי, המספק יתרונות נוספים של היתכנות בתחום.
רמות הסמים בשיער שימשו זמן רב ביישומים משפטיים16. במהלך העשור האחרון, השיער תרופתי (arv) רמות הפגינו השירות בהערכת דבקות התרופה ב-HIV טיפול ומניעה, אשר הקבוצה שלנו תרמו. רמות arv בשיער הוכחו להיות החזק ביותר הפרמנטורים עצמאיים של תוצאות הטיפול בנגיף HIV17,18,19,20,21. כדי לקבוע אם רמות השיער של חולים DR-TB יהיה שירות זהה בניבוי תוצאת הטיפול, השתמשנו LC-MS/MS כדי לפתח ולאמת שיטה לניתוח 11 התרופות DR-TB בדגימות שיער קטן. כהערכה ראשונית של ביצועי הטיפול, אנו מודדים DR-TB רמות התרופות במדגם הנוחות של חולים עם DR-TB מקבל טיפול ישיר (DOT) בקייפ המערבי, דרום אפריקה22.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מדווחים כאן פרוטוקול עבור השיטה שפיתחנו ואומת עבור כימות 11 נגד שחפת תרופות מנוצל בטיפול של DR-TB דגימות שיער קטנות באמצעות LC-MS/MS. אין שיטה אחרת עבור כימות אלה 11 תרופות בשיער פותחה בעבר, מאומת ופורסם. השיטה שלנו יכולה לכמת תת-ננו רמות של תרופות רק 20-30 קווצות שיער של כ 3 סנטימטרים (cm) אורך (~ 2 מ”?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לפרופסור Keertan Dheda, ד ר עלי Esmail, ו מאריטג’יאה פרטוריוס באוניברסיטת קייפ טאון המכון לריאות שהקל על אוסף דגימות שיער למחקר. המחברים מכירים בהכרת העבודה את התרומות של המשתתפים במחקר.
Materials
| 2 mL injection vials | Agilent Technologies | 5182-0716 | |
| 250 uL injection vial inserts | Agilent Technologies | 5181-8872 | |
| Bead ruptor 24 | OMNI International | 19001 | |
| Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) | OMNI International | 19628 | |
| Bedaquiline | Toronto Research Chemicals | B119550 | |
| Bedaquiline-d6 | Toronto Research Chemicals | B119552 | |
| Clofazimine | Toronto Research Chemicals | C324300 | |
| Clofazimine-d7 | Toronto Research Chemicals | C324302 | |
| Disposable lime glass culture tubes | VWR | 60825-425 | |
| Ethambutol | Toronto Research Chemicals | E889800 | |
| Ethambutol-d4 | Toronto Research Chemicals | E889802 | |
| Ethionamide | Toronto Research Chemicals | E890420 | |
| Ethionamide-d5 | ClearSynth | CS-O-06597 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507-100mL | |
| Glass bottles | Corning | 1395-1L | |
| Hot Shaker | Bellco Glass Inc | 7746-32110 | |
| HPLC | Agilent Technologies | Infinity 1260 | |
| HPLC grade acetonitrile | Honeywell | 015-4 | |
| HPLC grade methanol | Honeywell | 230-1L | |
| HPLC grade water | Aqua Solutions Inc | W1089-4L | |
| Isoniazid | Toronto Research Chemicals | I821450 | |
| Isoniazid-d4 | Toronto Research Chemicals | I821452 | |
| LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm | Phenomenex | 00D-4371-B0 | |
| LC guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8788 | |
| LC guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | |
| LC-MS/MS quantitation software | Sciex | Multiquant 2.1 | |
| Levofloxacin | Sigma-Aldrich | 1362103-200MG | |
| Levofloxacin-d8 | Toronto Research Chemicals | L360002 | |
| Linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| Linezolid-d3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | |
| Micro centrifuge tubes | E&K Scientific | 695554 | |
| Moxifloxacin | Toronto Research Chemicals | M745000 | |
| Moxifloxacin-13C, d3 | Toronto Research Chemicals | M745003 | |
| MS/MS | Sciex | Triple Quad 5500 | |
| OPC 14714 | Toronto Research Chemicals | O667600 | |
| Pretomanid (PA-824) | Toronto Research Chemicals | P122500 | |
| Prothionamide | Toronto Research Chemicals | P839100 | |
| Prothionamide-d5 | Toronto Research Chemicals | P839102 | |
| Pyrazinamide | Toronto Research Chemicals | P840600 | |
| Pyrazinamide-15N, d3 | Toronto Research Chemicals | P840602 | |
| Septum caps for injection vials | Agilent Technologies | 5185-5862 | |
| Turbovap LV evaporator | Biotage | 103198/11 |
References
- Kurbatova, E. V., et al. Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects. Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).
- Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Respiratory Medicine. , (2017).
- Berg, K. M., Arnsten, J. H. Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence. Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, 79-87 (2006).
- Kagee, A., Nel, A. Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures. AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).
- Haberer, J. E., et al. Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa. PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).
- Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. Time to stop counting the tablets. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).
- Liu, H., et al. A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors. Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).
- Wendel, C., et al. Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic. Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).
- Ruiz, J., et al. Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients. Clinical Pharmacology & Therapeutic. , (2019).
- Saktiawati, A. M., et al. Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis. Clinical Phamacokinetics. , (2019).
- Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. “White coat compliance” limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients. HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).
- Cuypers, E., Flanagan, R. J. The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites. Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).
- Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. Hair analysis for drug detection. Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).
- Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology. Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).
- Gandhi, M., et al. Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy. Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).
- Koss, C. A., et al. Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women. AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).
- Pintye, J., et al. Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).
- Baxi, S. M., et al. Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients. PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).
- Gandhi, M., et al. Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial. Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).
- Gerona, R., et al. Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel. Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).
- Metcalfe, J., et al. Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB. European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).
- Metcalfe, J. Z., O’Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis. PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).
