小さな毛髪サンプルで11の薬剤耐性結核薬を定量化するための検証済みのLC-MS/MSパネル
Summary
複雑な薬剤耐性結核(DR-TB)レジメンへの患者の付着を分析する現在の方法は、不正確でリソース集約的な可能性があります。当社の方法は、11のDR-TB薬の濃度について、容易に採取され保存されたマトリックスである毛髪を分析します。LC-MS/MSを用いて、薬物の付着をよりよく理解するために利用できるサブナノグラムの薬物レベルを決定することができます。
Abstract
薬剤耐性結核(DR-TB)は公衆衛生上の脅威の増大であり、治療薬レベルの評価には重要な臨床的利点がある可能性があります。血漿薬物レベルは現在のゴールドスタンダード評価ですが、フレボトミーとコールドチェーンを必要とし、非常に最近の付着のみをキャプチャします。当社の方法は、11の抗結核薬をテストするために、収集が容易で長期的な付着を反映するマトリックスである髪を使用しています。私たちのグループによる以前の研究は、髪の抗レトロウイルス薬レベルがHIVの結果に関連していることを示しています。DR-TB薬の私達の方法は、2mgの毛(根に近い3cmの近位)を使用し、メタノールで粉砕および抽出されます。サンプルは単一のLC-MS/MS法で分析され、16分で11の薬剤を定量化します。11の薬剤の定量(LLOQ)の下限は0.01 ng/mgから1 ng/mgの範囲である。サンプルは、重水素化、15N-または13C標識薬物アイソトポログに対する薬物の面積比を使用して定量化される。0.001~100 ng/mgの範囲の較正曲線を用いた。 DR-TB患者から採取した毛髪サンプルの都合のよいサンプルへのこの方法の適用は、直接観察された治療(DOT)において、9種類の薬物(イソニアジド、ピラジナミド、エタンブトール、リネゾリド、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、クロファジミン、ベダキリン、プレトマン)の直線的なダイナミックレンジ内の毛髪の薬物レベルを示した。プロチオンアミドの患者はおらず、エチオンアミドの測定レベルはLLOQに近かった(代わりにエチオンアミドの代謝産物の適合性を検査して暴露を監視する)。要約すると、薬剤耐性結核治療中の薬剤モニタリングのための技術として、毛髪中のDR-TB薬用多検体パネルの開発について述べています。
Introduction
21世紀において、薬剤耐性結核(DR-TB)は、すでに弱い国家結核対策プログラムの進化する大惨事であり、過去5年間だけで確認された症例は倍増し、世界的に1,22の抗菌性に関連する全死亡のほぼ3分の1を占めている。DR-TBの治療は、従来、薬物感受性結核の治療よりも長く、より有毒な第2ラインレジメンを必要としてきた。さらに、DR-TB患者は、しばしば、初期3の抵抗の出現に寄与した、遵守に重要な既存の課題を有する。
ウイルス負荷が治療を監視するために使用できるHIV感染とは異なり、結核における治療応答の代理エンドポイントは、個々のレベル4で遅延し、信頼性が低い。治療下の抗結核薬濃度および治療障害の重要な予測者である患者の付着を監視することも困難である。自己申告された遵守は、リコールバイアスとプロバイダ55、66を喜ばせたいという願望に苦しんでいます。ピル数と投薬イベント監視システム (MEMS) は、より客観的な7をすることができますが、実際の薬物消費量を測定しません8,9,10.バイオマトリスの薬物レベルは、付着データと薬物動態データの両方を提供することができます。従って、血漿薬物レベルは、治療用薬物モニタリング11,12,12において一般的に使用される。しかし、薬物付着モニタリングの文脈では、血漿レベルは短期的な暴露を表し、適切な付着基準範囲を決定する際に有意な患者間変動によって制限される。「ホワイトコート」効果は、診療所や研究訪問の前に付着が改善され、正確な薬物付着パターン13を提供する血漿レベルの能力をさらに複雑にする。
毛髪は、長期薬物暴露14,15,15を測定できる代替バイオマトリックスである。多くの薬物および内因性代謝産物は、毛髪が成長するにつれて全身循環から毛タンパク質マトリックスに組み込まれる。この動的プロセスは、毛髪の成長中に継続して、毛髪マトリックスに堆積する薬物の量は、循環する薬物の継続的な存在に依存し、毛髪は薬物摂取量の優れた時間的読み出しを行う。バイオマトリックスとしての毛髪は、血液と比較して保管および出荷のためのコールドチェーンを必要とせずに容易に収集されるという付加的な利点を有する。さらに、毛髪は非生物的有害性であり、この分野でさらなる実現可能性の利点を提供する。
毛髪薬のレベルは、長い法医学のアプリケーションで使用されてきました16.過去10年間で、毛髪抗レトロウイルス(ARV)レベルは、私たちのグループが貢献したHIV治療と予防における薬物遵守を評価する際の有用性を実証してきました。髪の毛のARVレベルは、HIV感染,,17、18、19、20、21,18における治療結果の最も強力な独立した予測変数であることが示されている。,192021DR-TB患者の毛髪レベルが治療結果を予測する際に同じ有用性を有するかどうかを判断するために、LC-MS/MSを使用して、小さな毛髪サンプル中の11個のDR-TB薬を分析する方法を開発し、検証しました。アッセイの性能の初期評価として、南アフリカ西ケープ州で直接観察治療(DOT)を受けているDR-TB患者のコンビニエンスサンプルでDR-TB薬レベルを測定した。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、LC-MS/MSを用いた小さな毛髪サンプルでのDR-TBの治療に利用される11の抗結核薬を定量化するために開発し、検証した方法のプロトコルを報告します。毛髪中のこれらの11の薬物を定量化するための他の方法は、以前に開発され、検証され、公開されていません。我々の方法は、約3センチメートル(cm)の長さ(〜2mg)のわずか20〜30本の毛鎖で薬物のサブナノグラムレベルを定量化すること…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ケープタウン肺大学のキールタン・デダ教授、アリ・エスメール博士、マリエチエ・プレトリウス教授に感謝したいと考えており、この研究のために毛髪サンプルの収集を促進した。著者らは、この研究の参加者の貢献をさらに感謝して認める。
Materials
| 2 mL injection vials | Agilent Technologies | 5182-0716 | |
| 250 uL injection vial inserts | Agilent Technologies | 5181-8872 | |
| Bead ruptor 24 | OMNI International | 19001 | |
| Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) | OMNI International | 19628 | |
| Bedaquiline | Toronto Research Chemicals | B119550 | |
| Bedaquiline-d6 | Toronto Research Chemicals | B119552 | |
| Clofazimine | Toronto Research Chemicals | C324300 | |
| Clofazimine-d7 | Toronto Research Chemicals | C324302 | |
| Disposable lime glass culture tubes | VWR | 60825-425 | |
| Ethambutol | Toronto Research Chemicals | E889800 | |
| Ethambutol-d4 | Toronto Research Chemicals | E889802 | |
| Ethionamide | Toronto Research Chemicals | E890420 | |
| Ethionamide-d5 | ClearSynth | CS-O-06597 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507-100mL | |
| Glass bottles | Corning | 1395-1L | |
| Hot Shaker | Bellco Glass Inc | 7746-32110 | |
| HPLC | Agilent Technologies | Infinity 1260 | |
| HPLC grade acetonitrile | Honeywell | 015-4 | |
| HPLC grade methanol | Honeywell | 230-1L | |
| HPLC grade water | Aqua Solutions Inc | W1089-4L | |
| Isoniazid | Toronto Research Chemicals | I821450 | |
| Isoniazid-d4 | Toronto Research Chemicals | I821452 | |
| LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm | Phenomenex | 00D-4371-B0 | |
| LC guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8788 | |
| LC guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | |
| LC-MS/MS quantitation software | Sciex | Multiquant 2.1 | |
| Levofloxacin | Sigma-Aldrich | 1362103-200MG | |
| Levofloxacin-d8 | Toronto Research Chemicals | L360002 | |
| Linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| Linezolid-d3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | |
| Micro centrifuge tubes | E&K Scientific | 695554 | |
| Moxifloxacin | Toronto Research Chemicals | M745000 | |
| Moxifloxacin-13C, d3 | Toronto Research Chemicals | M745003 | |
| MS/MS | Sciex | Triple Quad 5500 | |
| OPC 14714 | Toronto Research Chemicals | O667600 | |
| Pretomanid (PA-824) | Toronto Research Chemicals | P122500 | |
| Prothionamide | Toronto Research Chemicals | P839100 | |
| Prothionamide-d5 | Toronto Research Chemicals | P839102 | |
| Pyrazinamide | Toronto Research Chemicals | P840600 | |
| Pyrazinamide-15N, d3 | Toronto Research Chemicals | P840602 | |
| Septum caps for injection vials | Agilent Technologies | 5185-5862 | |
| Turbovap LV evaporator | Biotage | 103198/11 |
References
- Kurbatova, E. V., et al. Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects. Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).
- Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Respiratory Medicine. , (2017).
- Berg, K. M., Arnsten, J. H. Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence. Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, 79-87 (2006).
- Kagee, A., Nel, A. Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures. AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).
- Haberer, J. E., et al. Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa. PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).
- Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. Time to stop counting the tablets. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).
- Liu, H., et al. A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors. Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).
- Wendel, C., et al. Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic. Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).
- Ruiz, J., et al. Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients. Clinical Pharmacology & Therapeutic. , (2019).
- Saktiawati, A. M., et al. Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis. Clinical Phamacokinetics. , (2019).
- Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. “White coat compliance” limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients. HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).
- Cuypers, E., Flanagan, R. J. The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites. Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).
- Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. Hair analysis for drug detection. Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).
- Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology. Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).
- Gandhi, M., et al. Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy. Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).
- Koss, C. A., et al. Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women. AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).
- Pintye, J., et al. Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).
- Baxi, S. M., et al. Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients. PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).
- Gandhi, M., et al. Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial. Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).
- Gerona, R., et al. Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel. Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).
- Metcalfe, J., et al. Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB. European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).
- Metcalfe, J. Z., O’Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis. PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).
