JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
自动翻译
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物学

Chemische dimerisatie-geïnduceerde eiwitcondensaten op telomeren

Published: April 12, 2021
doi:
10.3791/62173
, ,
1Department of Biological Sciences, Mellon College of Science,Carnegie Mellon University, 2Department of Chemistry, School of Arts and Sciences,University of Pennsylvania

Summary

Dit protocol illustreert een chemisch geïnduceerd eiwitdimeerisatiesysteem om condensaten op chromatine te maken.  De vorming van promyelocytaire leukemie (PML) nucleair lichaam op telomeren met chemische dimerizers is aangetoond. Druppelgroei, oplossing, lokalisatie en samenstelling worden gemonitord met live cell imaging, immunofluorescentie (IF) en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH).

Abstract

Chromatine-geassocieerde condensaten zijn betrokken bij veel nucleaire processen, maar de onderliggende mechanismen blijven ongrijpbaar. Dit protocol beschrijft een chemisch geïnduceerd eiwitdimerisatiesysteem om condensaten op telomeren te creëren. De chemische dimerizer bestaat uit twee gekoppelde liganden die elk kunnen binden aan een eiwit: Halo ligand aan Halo-enzym en trimethoprim (TMP) aan E. coli dihydrofolaat reductase (eDHFR), respectievelijk. Fusie van Halo-enzym tot een telomeereiwit verankert dimerizers aan telomeren door covalente Halo-ligand-enzymbinding. Binding van TMP aan eDHFR rekruteert eDHFR-gefuseerde fasescheidende eiwitten aan telomeren en induceert condensaatvorming. Omdat de interactie tussen TMP en eDHFR niet-covalent is, kan condensatie worden omgekeerd door overtollige vrije TMP te gebruiken om te concurreren met de dimerizer voor eDHFR-binding. Een voorbeeld van het induceren van promyelocytaire leukemie (PML) nucleaire lichaamsvorming op telomeren en het bepalen van condensaatgroei, oplossing, lokalisatie en samenstelling wordt getoond. Deze methode kan eenvoudig worden aangepast om condensaten op andere genomische locaties te induceren door Halo te fuseren met een eiwit dat direct bindt aan het lokale chromatine of aan dCas9 dat is gericht op de genomische locus met een gids-RNA. Door de temporele resolutie te bieden die nodig is voor live beeldvorming met één cel met behoud van fasescheiding in een populatie van cellen voor biochemische assays, is deze methode geschikt voor het onderzoeken van zowel de vorming als de functie van chromatine-geassocieerde condensaten.

Introduction

Veel eiwitten en nucleïnezuren ondergaan vloeistof-vloeistoffasescheiding (LLPS) en assembleren zichzelf tot biomoleculaire condensaten om de biochemie in cellen te organiseren1,2. LLPS van chromatine-bindende eiwitten leidt tot de vorming van condensaten die geassocieerd zijn met specifieke genomische loci en betrokken zijn bij verschillende lokale chromatinefuncties3. LLPS van HP1-eiwit ligt bijvoorbeeld ten grondslag aan de vorming van heterochromatinedomeinen om het genoom te organiseren4,5,LLPS van transcriptiefactoren vormt transcriptiecentra om transcriptie te reguleren6, LLPS van ontluikende mRNA’s en multi-sex kammen eiwit genereert histon locus lichamen om de transcriptie en verwerking van histon mRNA’s te reguleren7.  Ondanks vele voorbeelden van chromatine-geassocieerde condensaten die worden ontdekt, blijven de onderliggende mechanismen van condensaatvorming, regulatie en functie echter slecht begrepen. In het bijzonder worden niet alle chromatine-geassocieerde condensaten gevormd door LLPS en zorgvuldige evaluaties van condensaatvorming in levende cellen zijn nog steeds nodig8,9. Het HP1-eiwit in de muis blijkt bijvoorbeeld slechts een zwak vermogen te hebben om vloeistofdruppels in levende cellen te vormen en heterochromatine foci gedragen zich als ingeklapte polymeerbolletjes10. Daarom zijn hulpmiddelen om de novo condensaten op chromatine in levende cellen te induceren wenselijk, met name die welke het gebruik van live imaging en biochemische assays mogelijk maken om de kinetiek van condensaatvorming, de fysische en chemische eigenschappen van de resulterende condensaten en de cellulaire gevolgen van condensaatvorming te volgen.

Dit protocol rapporteert een chemisch dimerisatiesysteem om eiwitcondensaten op chromatine11 te induceren(figuur 1A). De dimerizer bestaat uit twee gekoppelde eiwit-interagerende liganden: trimethoprim (TMP) en Halo ligand en kan eiwitten dimmeriseren die zijn gefuseerd met de cognate receptoren: Escherichia coli dihydrofolaat reductase (eDHFR) en een bacterieel alkyldehalogenase-enzym (Halo-enzym), respectievelijk12. De interactie tussen Halo-ligand en Halo-enzym is covalent, waardoor Halo-enzym als anker kan worden gebruikt door het samen te smelten met een chromatinebindend eiwit om een fasescheidend eiwit te rekruteren dat is gefuseerd met eDHFR tot chromatine. Na de initiële rekrutering passeert een verhoogde lokale concentratie van het fasescheidende eiwit de kritische concentratie die nodig is voor fasescheiding en nucleeert zo een condensaat aan het anker (figuur 1B). Door fluorescerende eiwitten (bijv. mCherry en eGFP) te fuseren met eDHFR en Halo, kunnen nucleatie en groei van condensaten in realtime worden gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie. Omdat de interactie tussen eDHFR en TMP niet-covalent is, kan overtollig vrij TMP worden toegevoegd om te concurreren met de dimeerizer voor eDHFR-binding. Dit zal dan het fasescheidingseiwit uit het anker vrijgeven en het chromatine-geassocieerde condensaat oplossen.

We gebruikten deze tool om de novo promyelocytaire leukemie (PML) nucleaire lichaamsvorming op telomeren in telomerase-negatieve kankercellen te induceren die een alternatieve verlenging van telomeren (ALT) pathway gebruiken voor telomeeronderhoud13,14.  PML-nucleaire lichamen zijn membraanloze compartimenten die betrokken zijn bij veel nucleaire processen15,16 en zijn uniek gelokaliseerd voor ALT-telomeren om APBs te vormen, voor ALT-telomeer-geassocieerde PML-lichamen17,18. Telomeren clusteren binnen APB’s, vermoedelijk om reparatiesjablonen te bieden voor homologie-gerichte telomeer-DNA-synthese in ALT19. Inderdaad, telomeer DNA-synthese is gedetecteerd in APBs en APBs spelen een essentiële rol bij het verrijken van DNA-reparatiefactoren op telomeren20,21. De mechanismen die ten grondslag liggen aan APB-assemblage en telomeerclustering binnen APB’s waren echter onbekend. Aangezien telomeereiwitten in ALT-cellen uniek worden gemodificeerd door kleine ubiquitine-achtige modifier (SUMOs)22, bevatten veel APB-componenten sumillatieplaatsen 22,23,24,25 en / of SUMO-interacterende motieven (SIM’s)26,27 en SUMO-SIM-interacties drijven fasescheiding28, we veronderstelden dat sumoyatie op telomeren leidt tot verrijking van SUMO / SIM-bevattende eiwitten en SUMO-SIM interacties tussen die eiwitten leiden tot fasescheiding.  PML-eiwit, dat drie sumoylation-sites en één SIM-site heeft, kan worden gerekruteerd om gecongloleerde telomeren te vormen om APBs te vormen en coalescentie van vloeibare APBs leidt tot clustering van telomeren. Om deze hypothese te testen, gebruikten we het chemische dimerisatiesysteem om sumillatie-geïnduceerde APB-formatie na te bootsen door SIM te rekruteren voor telomeren (Figuur 2A)11. GFP is gefuseerd met Halo-enzym voor visualisatie en met het telomeerbindende eiwit TRF1 om de dimerizer aan telomeren. SIM is gefuseerd met eDHFR en mCherry. Kinetiek van condensaatvorming en druppelfusie-geïnduceerde telomeerclustering worden gevolgd met live celbeeldvorming.  Fasescheiding wordt omgekeerd door overtollige vrije TMP toe te voegen om te concurreren met eDHFR-binding. Immunofluorescentie (IF) en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) worden gebruikt om de condensaatsamenstelling en telomerische associatie te bepalen. Recruiting SIM verrijkt SUMO op telomeren en de geïnduceerde condensaten bevatten PML en zijn daarom APBs. Het rekruteren van een SIM-mutant die niet kan interageren met SUMO verrijkt SUMO niet op telomeren of induceert geen fasescheiding, wat aangeeft dat de fundamentele drijvende kracht voor APB-condensatie SUMO-SIM-interactie is. In overeenstemming met deze observatie kunnen polySUMO-polySIM-polymeren die zijn gefuseerd tot een TRF2-bindingsfactor RAP1 ook APB-vorming29induceren. Vergeleken met het polySUMO-polySIM-fusiesysteem waarbij fasescheiding plaatsvindt zolang er voldoende eiwitten worden geproduceerd, induceert de chemische dimerisatiebenadering die hier wordt gepresenteerd fasescheiding op aanvraag en biedt dus een betere temporele resolutie om de kinetiek van fasescheiding en telomeerclusteringsproces te bewaken. Bovendien maakt dit chemische dimerisatiesysteem de rekrutering van andere eiwitten mogelijk om hun vermogen te beoordelen om fasescheiding en telomeerclustering te induceren. Een ongeorded eiwit dat wordt gerekruteerd voor telomeren kan bijvoorbeeld ook druppels en clustertelomeren vormen zonder APB-vorming te induceren, wat suggereert dat telomeerclustering onafhankelijk is van APB-chemie en alleen afhankelijk is van APB vloeibare eigenschap11.

Protocol

1. Productie van voorbijgaande cellijnen Kweek U2OS-acceptorcellen op glazen coverslips van 22 x 22 mm (voor live beeldvorming) of cirkelvormige coverslips met een diameter van 12 mm (voor IF of FISH) bedekt met poly-D-lysine in een 6-putplaat met groeimedium (10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine-oplossing in DMEM) totdat ze 60-70% confluency bereiken. Vervang groeimedium door 1 ml transfectiemedium (groeimedium zonder penicilline-streptomycine-oplossing) voorafgaan…

Representative Results

Representatieve beelden van telomerische lokalisatie van SUMO geïdentificeerd door telomeer DNA FISH en SUMO-eiwit IF zijn weergegeven in figuur 2. Cellen met SIM-rekrutering verrijkten SUMO1 en SUMO 2/3 op telomeren in vergelijking met cellen met SIM-mutantenrekrutering. Dit geeft aan dat SIM-dimerisatie-geïnduceerde SUMO-verrijking op telomeren afhankelijk is van SUMO-SIM-interacties. Een representatieve timelapse film van TRF1 en SIM na dimerisatie wordt geto…

Discussion

Dit protocol demonstreerde de vorming en oplossing van condensaten op telomeren met een chemisch dimerisatiesysteem. Kinetiek van fasescheiding en druppel-fusie-geïnduceerde telomeerclustering worden gemonitord met live beeldvorming. Condensaatlokalisatie en samenstelling worden bepaald met DNA FISH en eiwit IF.

Er zijn twee cruciale stappen in dit protocol. De eerste is om de eiwit- en dimerizerconcentratie te bepalen. Het succes bij het induceren van lokale fasescheiding op een genomische l…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (1K22CA23763201 tot H.Z., GM118510 tot D.M.C.) en Charles E. Kaufman Foundation tot H.Z. De auteurs willen Jason Tones bedanken voor het proeflezen van het manuscript.

Materials

0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate Corning MT25053CI
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo Scientific 28906 Prepare 1% in 1x PBS
6 Well Culture Plate VWR 10861-554
Aluminum Foil Fisher Scientific 01-213-101
Anti-mCherry antibody Abcam Ab183628
Anti-PML antibody Santa Cruz sc966
Anti-SUMO1 antibody Abcam Ab32058
Anti-SUMO2/3 antibody Cytoskeleton Asm23
Blocking Reagent Roche 11096176001
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP9706100
BTX Tube micro 1.5ML  VWR 89511-258
Circle Cover Slips Thermo Scientific 3350
Confocal microscope  Nikon MQS31000
DAPI Fisher Scientific D1306
Dimethyl Sulphoxide  Sigma-Aldrich 472301
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Corning MT10017CV
EMCCD Camera iXon Life  897
Ethanol Fisher Scientific 4355221
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions Gibco A4766801
Formamide, Deionized MilliporeSigma 46-101-00ML
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A28181
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A32733
High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-122
Laser merge module  Nikon NIIMHF47180
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 21083027
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen 11668027
Figure plotting software, MATLAB The MathWorks
Microscope Slide Box Fisher Scientific 34487
Nail Polish Fisher Scientific 50-949-071
Imaging software, NIS-Elements  Nikon
Opti-MEM Reduced Serum Media Gibco 51985091
Parafilm Bemis 13-374-12
PBS 10x, pH 7.4 Fisher Scientific 70-011-044
Penicillin-Streptomycin Solution,100X Gibco 15140122
Piezo Z-Drive  Physik Instrumente (PI) 91985
Pipet Tips VWR 10017
Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides Fisher Scientific 22-037-246
Poly-D-Lysine solution Sigma-Aldrich A-003-E
Sodium Azide Fisher Scientific BP922I-500
Spinning disk Yokogawa CSU-X1
Square Cover Slips Thermo Scientific 3305
TBS 10x solution Fisher Scientific BP2471500
TelC-Alexa488 PNA Bio F1004
TMP Synthesized by Chenoweth lab Available upon request
TNH Synthesized by Chenoweth lab Available upon request
Tris Solution Fisher Scientific 92-901-00ML
Triton X-100 10% Solution MilliporeSigma 64-846-350ML Prepare 0.5% in 1x PBS
U2Os cell line From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) HTB-96
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Laboratories NC9524612
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
  2. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
  3. Sabari, B. R., Dall’Agnese, A., Young, R. A. Biomolecular condensates in the nucleus. Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).
  4. Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
  5. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
  6. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  7. Hur, W., et al. CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies. Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).
  8. McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Genes & Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
  9. Peng, A., Weber, S. C. Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus. Non-coding RNA. 5 (4), (2019).
  10. Erdel, F., et al. Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation. Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).
  11. Zhang, H., et al. Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells. Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).
  12. Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 5, 1-9 (2014).
  13. Yeager, T. R., et al. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body. 癌症研究. 59 (17), 4175-4179 (1999).
  14. Zhang, J. M., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks. Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).
  15. Corpet, A., et al. PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can. Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).
  16. Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy. Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).
  17. Dilley, R. L., Greenberg, R. A. ALTernative telomere maintenance and cancer. Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).
  18. Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge. Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).
  19. Draskovic, I., et al. Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726 (2009).
  20. Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways. Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).
  21. Loe, T. K., et al. Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres. Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).
  22. Potts, P. R., Yu, H. The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).
  23. Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation. Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).
  24. Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. The mechanisms of PML-nuclear body formation. Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).
  25. Shima, H., et al. Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage. Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).
  26. Yalçin, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction. Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).
  27. Sarangi, P., Zhao, X. SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses. Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).
  28. Banani, S. F., et al. Compositional control of phase-separated cellular bodies. Cell. 166 (3), 651-663 (2016).
  29. Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52. Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).
  30. Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).
  31. Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. Chapter 7 – Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers. Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).
  32. Zhang, H., et al. Optogenetic control of kinetochore function. Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).
  33. Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis. Cell. 159 (1), 108-121 (2014).
  34. Dilley, R. L., et al. Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance. Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).
  35. Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer. Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).
  36. Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
  37. Shin, Y., et al. Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome. Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).
  38. Xiang, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol. Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).

Tags

Keywords: Chemical DimerizationProtein CondensatesTelomeresChromatinLive Cell ImagingBiochemical AssaysHalo-GFP-TRF1MCherry-eDHFR-SIMMCherry-eDFR-SIMPMLSUMO-1SUMO-2SUMO-3DAPIImmunofluorescence
check_url/cn/62173?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhao, R., Chenoweth, D. M., Zhang, H. Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres. J. Vis. Exp. (170), e62173, doi:10.3791/62173 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image