Telomerlerde Kimyasal Dimerizasyona Bağlı Protein Kondensatları
Summary
Bu protokol, kromatin üzerinde kondensatlar oluşturmak için kimyasal olarak indüklenmiş bir protein dimerizasyon sistemini göstermektedir. Kimyasal dimerizatörlü telomerler üzerinde promiyelositik lösemi (PML) nükleer gövdesinin oluşumu gösterilmiştir. Damlacık büyümesi, çözünmesi, lokalizasyonu ve bileşimi canlı hücre görüntüleme, immünofluoresans (IF) ve floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile izlenir.
Abstract
Kromatinle ilişkili kondensatlar birçok nükleer proseste dahil edilir, ancak alttaki mekanizmalar zor bulunur. Bu protokol, telomerler üzerinde kondensatlar oluşturmak için kimyasal olarak indüklenen bir protein dimerizasyon sistemini açıklar. Kimyasal dimerizer, her biri bir proteine bağlanabilen iki bağlı liganddan oluşur: Halo ligand Halo enzimine ve trimethoprim ‘e (TMP) sırasıyla E. coli dihidrofolat redüktaz (eDHFR). Halo enziminin bir telomer proteinine füzyonu, dimerizatörleri katvalent Halo ligand enzim bağlama yoluyla telomerlere tuttur. TMP’nin eDHFR’ye bağlanması, proteinleri telomerlere ayıran eDHFR ile kaynaşmış fazı işe toplar ve yoğuşma oluşumunu teşvik eder. TMP-eDHFR etkileşimi kurvalent olmadığından, yoğunlaşma, eDHFR bağlama için dimerizer ile rekabet etmek için fazla boş TMP kullanılarak tersine çevrilebilir. Telomerler üzerinde promiyelositik lösemi (PML) nükleer vücut oluşumunun teşvik edilmesi ve yoğuşma büyümesi, çözünmesi, lokalizasyonu ve bileşiminin belirlenmesine örnek gösterilmiştir. Bu yöntem, Halo’yu doğrudan lokal kromatin veya bir kılavuz RNA ile genomik lokusa hedeflenen dCas9’a bağlayan bir proteine kaynaştırarak diğer genomik konumlardaki yoğuşmalara neden olmak için kolayca uyarlanabilir. Biyokimyasal tahliller için hücre popülasyonunda faz ayrımını korurken tek hücreli canlı görüntüleme için gereken zamansal çözünürlüğü sunarak, bu yöntem kromatin ilişkili kondensatların hem oluşumunu hem de işlevini yok etmek için uygundur.
Introduction
Birçok protein ve nükleik asit sıvı-sıvı faz ayrımına (LLPS) tabir edilir ve hücrelerde biyokimyayı düzenlemek için biyomoleküler kondensatlara kendiliğinden monte edilir1,2. Kromatin bağlayıcı proteinlerin LLPS’si, spesifik genomik loci ile ilişkili ve çeşitli lokal kromatin fonksiyonlarına karışan kondensatların oluşumuna yol açar3. Örneğin, HP1 proteininin LLPS’si, transkripsiyon4,5,TRANSKRipsiyon faktörlerinin LLPS’si transkripsiyon 6’yı düzenlemek için transkripsiyon merkezlerinin form transkripsiyon merkezlerini düzenlemek için heterokromatin etki alanlarının oluşumunun temelini oluşturur, nascent mRNA’ların LLPS’si ve çok cinsiyetli taraklar proteini, histone mRNA’larının transkripsiyonunu ve işlenmesini düzenlemek için histone lokus cisimleri üretir7. Bununla birlikte, kromatin ilişkili kondensatların keşfedildiği birçok örneğe rağmen, kondensat oluşumu, regülasyonu ve işlevinin altında bulunan mekanizmalar yeşaya iyi anlaşılmamaktadır. Özellikle, tüm kromatin ilişkili kondensatlar LLPS yoluyla oluşmaz ve canlı hücrelerde yoğuşma oluşumunun dikkatli değerlendirmelerine hala ihtiyaç vardır8,9. Örneğin, faredeki HP1 proteini canlı hücrelerde sıvı damlacıkları oluşturmak için sadece zayıf bir kapasiteye sahip olduğu ve heterokromatin odaklarının çökmüş polimer globülleri10gibi davrandığı gösterilmiştir. Bu nedenle, canlı hücrelerde kromatin üzerinde de novo kondensatları indükleyen araçlar, özellikle yoğuşma oluşumunun kinetiğini, ortaya çıkan kondensatların fiziksel ve kimyasal özelliklerini ve yoğuşma oluşumunun hücresel sonuçlarını izlemek için canlı görüntüleme ve biyokimyasal tahlillerin kullanılmasına izin veren araçlar arzu edilir.
Bu protokol, kromatin11’de protein kondensatlarını indük etmek için kimyasal bir karartma sistemi bildirir (Şekil 1A). Dimerizer iki bağlı protein etkileşimli liganddan oluşur: trimethoprim (TMP) ve Halo ligand ve konyak reseptörlerine kaynaşmış proteinleri küçültebilir: Escherichia coli dihidrofolat redüktaz (eDHFR) ve bakteriyel alkildehalogenaz enzimi (Halo enzimi), sırasıyla12. Halo ligand ve Halo enzimi arasındaki etkileşim, Halo enziminin kromatin bağlayıcı bir proteine kaynaştırılarak bir çapa olarak kullanılmasına izin vererek eDHFR ile kaynaşmış faz ayırıcı bir proteini kromatin ile bir hale getirmek için kullanılır. İlk işe alımdan sonra, faz ayırma proteininin artan lokal konsantrasyonu faz ayırma için gereken kritik konsantrasyonu geçirir ve böylece çapadaki bir yoğuşma çekirdeklerini atar (Şekil 1B). Floresan proteinlerin (örneğin mCherry ve eGFP) eDHFR ve Halo’ya kaynaştırılmasıyla, floresan mikroskopi ile çekirdeklenme ve yoğuşmaların büyümesi gerçek zamanlı olarak görselleştirilebilir. eDHFR ve TMP arasındaki etkileşim kurda olmayan olduğundan, eDHFR bağlama için dimerizer ile rekabet etmek için fazla ücretsiz TMP eklenebilir. Bu daha sonra faz ayırma proteinini çapadan serbest bırakacak ve kromatinle ilişkili yoğuşma çözünecektir.
Bu aracı telomer bakımı için alternatif bir telomer (ALT) yolu uzatma kullanan telomer negatif kanser hücrelerindeki telomerler üzerinde de novo promiyelositik lösemi (PML) nükleer vücut oluşumunu teşvik etmek için kullandık13,14. PML nükleer gövdeler, birçok nükleer proses15,16’da yer alan membransız bölmelerdir ve ALT telomer ilişkili PML gövdeleri 17,18için APB’ler oluşturmak için ALT telomerlere benzersiz bir şekilde lokalize edilir. Telomerler API’ler içinde kümelenir, muhtemelen ALT19’dahomolojiye yönelik telomer DNA sentezi için onarım şablonları sağlamak için. Gerçekten de, TELOMER DNA sentezi API’lerde tespit edilmiştir ve API’ler telomerlerde DNA onarım faktörlerini zenginleştirmede temel roller oynamaktadır20,21. Bununla birlikte, APB’ler içinde APB montajı ve telomer kümelemenin altında kalan mekanizmalar bilinmiyordu. ALT hücrelerindeki telomer proteinleri küçük ubiquitin benzeri değiştirici (SUMO’ lar)22tarafından benzersiz bir şekilde değiştirildiğinden, birçok APB bileşeni sumoylation siteleri 22 , 23,24,25 ve/veya SU içerirMO ile etkileşime giren motifler (SIM’ler)26,27 ve SUMO-SIM etkileşimleri fazayrımını 28’egötürür, telomerler üzerindeki sumoilasyonun protein içeren SUMO/ SIM’in zenginleşmesine yol açtığını ve Bu proteinler arasındaki SUMO-SIM etkileşimleri faz ayrımına yol açar. Üç sumoylation bölgesi ve bir SIM sitesi olan PML proteini, API’ler oluşturmak için sumoylated telomerlere işe alınabilir ve sıvı USB’lerin birleşmesi telomer kümelenmesine yol açar. Bu hipotezi test etmek için, telomerlere SIM alarak sumoilasyon kaynaklı APB oluşumunu taklit etmek için kimyasal dimerizasyon sistemini kullandık (Şekil 2A)11. GFP, görselleştirme için Haloenzim’e ve dimerizörü telomerlere tutturmak için telomer bağlayıcı protein TRF1’e kaynaştırılır. SIM, eDHFR ve mCherry ile kaynaşmıştır. Canlı hücre görüntüleme ile kondensat oluşumu ve damlacık füzyon kaynaklı telomer kümelenmesi kinetiği takip edilir. Faz ayrımı, eDHFR bağlama ile rekabet etmek için fazla boş TMP eklenerek tersine çevrilir. Kondens bileşimini ve telomerik ilişkiyi belirlemek için immünoresans (IF) ve floresan in situ hibridizasyon (FISH) kullanılır. SIM alımı telomerlerde SUMO’yu zenginleştirir ve indüklenen kondensatlar PML içerir ve bu nedenle API’lerdir. SUMO ile etkileşime giremeyen bir SIM mutantını işe almak, TELOMERLER üzerinde SUMO’yu zenginleştirmez veya faz ayrımına neden olmaz, bu da APB yoğuşması için temel itici gücün SUMO-SIM etkileşimi olduğunu gösterir. Bu gözleme katılarak, TRF2 bağlayıcı faktör RAP1 ile kaynaşmış poliSUMO-polySIM polimerleri de APB oluşumunu teşvik edebilir29. Yeterli protein üretildiği sürece faz ayrımının gerçekleştiği poliSUMO-polisSIM füzyon sistemi ile karşılaştırıldığında, burada sunulan kimyasal dimerizasyon yaklaşımı talep üzerine faz ayrımına neden olur ve böylece faz ayırma ve telomer kümeleme işleminin kinetiğini izlemek için daha iyi zamansal çözünürlük sunar. Ek olarak, bu kimyasal dimerizasyon sistemi, faz ayırma ve telomer kümelemedeki yeteneklerini değerlendirmek için diğer proteinlerin işe alınmasına izin veriyor. Örneğin, telomerlere katılan düzensiz bir protein, APB oluşumunu teşvik etmeden damlacıklar ve küme telomerleri de oluşturabilir, bu da telomer kümelemenin APB kimyası bağımsız olduğunu ve sadece APB sıvı özelliğine dayandığını öne sürmez11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, telomerler üzerindeki kondensatların kimyasal bir dimerizasyon sistemi ile oluşumunu ve çözünmesini göstermiştir. Faz ayırma kinetiği ve damlacık füzyon kaynaklı telomer kümelenmesi canlı görüntüleme ile izlenir. Yoğuşma lokalizasyonu ve bileşimi DNA FISH ve protein IF ile belirlenir.
Bu protokolde iki kritik adım vardır. Birincisi protein ve dimerizer konsantrasyonunu belirlemektir. Genomik bir lokusta lokal faz ayrımını teşvik etmedeki başarı, faz ay…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (1K22CA23763201’den H.Z.’ye, GM118510’dan D.M.C.’ye) ve Charles E. Kaufman vakfı tarafından H.Z. Yazarlar, makaleyi düzelttikten sonra Jason Tones’a teşekkür etmek istiyor.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | MT25053CI | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | Prepare 1% in 1x PBS |
| 6 Well Culture Plate | VWR | 10861-554 | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anti-mCherry antibody | Abcam | Ab183628 | |
| Anti-PML antibody | Santa Cruz | sc966 | |
| Anti-SUMO1 antibody | Abcam | Ab32058 | |
| Anti-SUMO2/3 antibody | Cytoskeleton | Asm23 | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| Circle Cover Slips | Thermo Scientific | 3350 | |
| Confocal microscope | Nikon | MQS31000 | |
| DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10017CV | |
| EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Gibco | A4766801 | |
| Formamide, Deionized | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Laser merge module | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
| Figure plotting software, MATLAB | The MathWorks | ||
| Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
| Nail Polish | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| Imaging software, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution,100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Pipet Tips | VWR | 10017 | |
| Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Poly-D-Lysine solution | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Spinning disk | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x solution | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| TNH | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0.5% in 1x PBS |
| U2Os cell line | From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
References
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
- Sabari, B. R., Dall’Agnese, A., Young, R. A. Biomolecular condensates in the nucleus. Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).
- Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
- Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
- Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
- Hur, W., et al. CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies. Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).
- McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Genes & Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
- Peng, A., Weber, S. C. Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus. Non-coding RNA. 5 (4), (2019).
- Erdel, F., et al. Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation. Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).
- Zhang, H., et al. Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells. Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).
- Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 5, 1-9 (2014).
- Yeager, T. R., et al. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body. 癌症研究. 59 (17), 4175-4179 (1999).
- Zhang, J. M., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks. Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).
- Corpet, A., et al. PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can. Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).
- Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy. Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).
- Dilley, R. L., Greenberg, R. A. ALTernative telomere maintenance and cancer. Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).
- Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge. Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).
- Draskovic, I., et al. Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726 (2009).
- Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways. Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).
- Loe, T. K., et al. Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres. Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).
- Potts, P. R., Yu, H. The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).
- Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation. Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).
- Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. The mechanisms of PML-nuclear body formation. Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).
- Shima, H., et al. Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage. Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).
- Yalçin, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction. Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).
- Sarangi, P., Zhao, X. SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses. Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).
- Banani, S. F., et al. Compositional control of phase-separated cellular bodies. Cell. 166 (3), 651-663 (2016).
- Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52. Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).
- Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).
- Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. Chapter 7 – Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers. Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).
- Zhang, H., et al. Optogenetic control of kinetochore function. Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).
- Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis. Cell. 159 (1), 108-121 (2014).
- Dilley, R. L., et al. Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance. Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).
- Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer. Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).
- Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
- Shin, Y., et al. Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome. Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).
- Xiang, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol. Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).
