פרוטוקול זה ממחיש מערכת עמעום חלבונים המושרה כימית ליצירת עיבויים על כרומטין. היווצרות של לוקמיה פרומיאלוציטית (PML) גוף גרעיני על טלומרים עם דימריזרים כימיים הוא הודגם. צמיחה טיפה, פירוק, לוקליזציה והרכב מנוטרים עם הדמיית תאים חיים, אימונופלואורסצנטיות (IF) ופלואורסצנטיות בהכלאה במקום (FISH).
עיבויים הקשורים לכרומטין מעורבים בתהליכים גרעיניים רבים, אך המנגנונים הבסיסיים נותרים חמקמקים. פרוטוקול זה מתאר מערכת עמעום חלבונים המושרה כימית ליצירת עיבויים בטלומרים. הדימרייזר הכימי מורכב משני ליגנדים מקושרים שיכולים להיקשר כל אחד לחלבון: ליגנד Halo ל-Halo-enzyme וטימופרים (TMP) ל-E. coli dihydrofolate reductase (eDHFR), בהתאמה. היתוך של אנזים Halo לחלבון טלומר מעגן דימריזרים לטלומרים באמצעות כריכת אנזים הילה ליגנד קוולנטית. כריכה של TMP ל- eDHFR מגייסת שלב מותך eDHFR המפריד חלבונים לטלומרים ודורשת היווצרות עיבוי. מכיוון שאינטראקציית TMP-eDHFR אינה קוולנטית, ניתן להפוך עיבוי באמצעות TMP חינם עודף כדי להתחרות בדיימר עבור איגוד eDHFR. דוגמה של גרימת היווצרות גוף גרעיני של לוקמיה פרומיאלוציטית (PML) בטלומרים וקביעת צמיחה עיבוי, פירוק, לוקליזציה והרכב מוצגת. שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות כדי לגרום עיבוי במקומות גנומיים אחרים על ידי היתוך Halo לחלבון שנקשר ישירות לכרומטין המקומי או dCas9 כי הוא ממוקד לוקוס גנומי עם RNA מדריך. על ידי הצעת הרזולוציה הזמנית הנדרשת להדמיה חיה של תא יחיד תוך שמירה על הפרדת פאזה באוכלוסיית תאים לבדיקות ביוכימיות, שיטה זו מתאימה לבדיקת היווצרות ותפקוד של עיבויים הקשורים לכרומטין.
חלבונים וחומצות גרעין רבים עוברים הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית (LLPS) ומרכיבים את עצמם לתוך עיבויים ביומולקולריים כדי לארגן ביוכימיה בתאים1,2. LLPS של חלבונים מחייב כרומטין מוביל להיווצרות של עיבויים הקשורים loci גנומי ספציפי והם מעורבים פונקציות כרומטין מקומיות שונות3. לדוגמה, LLPS של חלבון HP1 עומד בבסיס היווצרות של תחומים הטרוכרומטינים כדי לארגן את הגנום4,5, LLPS של גורמי שעתוק יוצר מרכזי שעתוק כדי לווסת את שעתוק6, LLPS של mRNAs המתהווה וחלבון מסרקים מרובי מיניים מייצר גופי לוקוס histone כדי לווסת את שעתוק ועיבוד של histone mRNAs7. עם זאת, למרות דוגמאות רבות של עיבוי הקשורים כרומטין מתגלה, המנגנונים הבסיסיים של היווצרות עיבוי, רגולציה ותפקוד להישאר מובן היטב. בפרט, לא כל עיבוי הקשורים כרומטין נוצרים באמצעות LLPS והערכות זהירה של היווצרות עיבוי בתאים חיים עדיין נדרשים8,9. לדוגמה, חלבון HP1 בעכבר מוצג כבעל יכולת חלשה בלבד ליצור טיפות נוזליות בתאים חיים ומוקדי הטרוכרומטין מתנהגים כמו כדוריות פולימר שקרסו10. לכן, כלים כדי לגרום de novo עיבויים על כרומטין בתאים חיים רצויים, במיוחד אלה המאפשרים שימוש בהדמיה חיה וביקורת ביוכימית כדי לפקח על הקינטיקה של היווצרות עיבוי, התכונות הפיזיות והכימיות של העיבויים המתקבלים, ואת ההשלכות התאיות של היווצרות עיבוי.
פרוטוקול זה מדווח על מערכת עמעום כימית כדי לגרום לעיבוי חלבון בכרומטין11 (איור 1A). הדימרייזר מורכב משני ליגנדים מקושרים המקיימים אינטראקציה עם חלבונים: טרימתופרים (TMP) וליגנד Halo ויכול לעמעם חלבונים המותכים לקולטני הקוגניט: Escherichia coli dihydrofolate reductase (eDHFR) ואנזים אלקילדהלוגנאז חיידקי (אנזים Halo), בהתאמה12. האינטראקציה בין האנזים Halo ligand ואנזים Halo היא קוולנטית, ומאפשרת אנזים Halo לשמש עוגן על ידי היתוך אותו לחלבון מחייב כרומטין כדי לגייס חלבון הפרדת פאזה הותך eDHFR לכרומטין. לאחר הגיוס הראשוני, ריכוז מקומי מוגבר של השלב המפריד חלבון עובר את הריכוז הקריטי הדרוש להפרדת פאזה ובכך מגרגר עיבוי בעוגן (איור 1B). על ידי היתוך חלבונים פלואורסצנטיים (למשל mCherry ו- eGFP) ל- eDHFR והילה, ניתן לדמיין התגרענות וצמיחה של עיבויים בזמן אמת עם מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות. מכיוון שהאינטראקציה בין eDHFR ל- TMP אינה קוולנטית, ניתן להוסיף TMP ללא עודף כדי להתחרות בדיימר עבור איגוד eDHFR. לאחר מכן זה ישחרר את חלבון הפרדת הפאזה מהעוגן ולהמיס את העיבוי הקשור לכרומטין.
השתמשנו בכלי זה כדי לגרום להיווצרות גוף גרעיני של לוקמיה פרומיאלוציטית דה נובו (PML) בטלומרים בתאי סרטן שליליים טלומראז המשתמשים בהארכה חלופית של מסלול הטלומרים (ALT) לתחזוקת הטלומר13,14. גופים גרעיניים PML הם תאים ללא ממברנה המעורבים בתהליכים גרעיניים רבים15,16 והם מקומיים באופן ייחודי טלומר ALT כדי ליצור APBs, עבור גופי PML הקשורים טלומר ALT17,18. אשכול טלומרים בתוך APBs, ככל הנראה כדי לספק תבניות תיקון עבור סינתזת DNA טלומר מונחה הומולוגיה ב ALT19. ואכן, סינתזת DNA טלומר זוהתה APBs ו APBs לשחק תפקידים חיוניים העשרת גורמי תיקון DNA בטלומרים20,21. עם זאת, המנגנונים שבביד הרכבת APB ואשכול הטלומר בתוך APBs לא היו ידועים. מאז חלבוני טלומר בתאי ALT משתנים באופן ייחודי על ידי מחליף קטן דמוי אוביקוויטין (SUMOs)22, רכיבי APB רבים מכילים אתרי סומוילציה 22,23,24,25 ו / או מוטיבים אינטראקציה SUMO (SIMs)26,27 ואינטראקציות SUMO-SIM כונן הפרדת שלב28, שיערנו כי סומוילציה על טלומרים מוביל להעשרה של SUMO / SIM המכיל חלבונים ו אינטראקציות SUMO-SIM בין חלבונים אלה מובילות להפרדת פאזה. חלבון PML, שיש לו שלושה אתרי סומוילציה ואתר SIM אחד, ניתן לגייס טלומרים סומויליים כדי ליצור APBs והתמזגות של APBs נוזלי מוביל להתקבצות טלומרים. כדי לבחון השערה זו, השתמשנו במערכת הדממה הכימית כדי לחקות היווצרות APB הנגרמת על ידי סומוילציה על ידי גיוס SIM לטלומרים (איור 2A)11. GFP מותך Haloenzyme להדמיה ולחלבון טלומר מחייב TRF1 כדי לעגן את הדמיר לטלומרים. ה-SIM מותך ל-eDHFR ול-mCherry. קינטיקה של היווצרות עיבוי ו clustersion טיפה המושרה טלומר קיבוץ הם אחריו עם הדמיה תא חי. הפרדת הפאזה הפוכה על-ידי הוספת TMP חינם עודף כדי להתחרות בכריכה של eDHFR. אימונופלואורסצנטיות (IF) ופלואורסצנטיות בהכלאה במקום (FISH) משמשים לקביעת הרכב עיבוי ואיגוד טלומרי. גיוס SIM מעשיר את SUMO בטלומרים והמרוכזים המושרים מכילים PML ולכן הם APBs. גיוס מוטציה SIM שאינה יכולה לקיים אינטראקציה עם SUMO אינה מעשירה את SUMO בטלומרים או גורמת להפרדת פאזה, מה שמצביע על כך שהכוח המניע הבסיסי ל עיבוי APB הוא אינטראקציית SUMO-SIM. מסכים עם תצפית זו, פוליסומו-פוליסים פולימרים שהתמזגו לגורם מחייב TRF2 RAP1 יכול גם לגרום להיווצרות APB29. בהשוואה למערכת ההיתוך polySUMO-polySIM שבה הפרדת פאזה מתרחשת כל עוד מיוצרים מספיק חלבונים, גישת הדמיזציה הכימית המוצגת כאן גורמת להפרדת פאזה על פי דרישה ובכך מציעה רזולוציה זמנית טובה יותר לניטור הקינטיקה של הפרדת פאזה ותהליך קיבוץ הטלומר. בנוסף, מערכת עמעום כימית זו מאפשרת גיוס חלבונים אחרים כדי להעריך את יכולתם בגרימת הפרדת פאזה ואשכולות טלומר. לדוגמה, חלבון מופרע המגויס לטלומרים יכול גם ליצור טיפות וטלומרים מקבצי מבלי לגרום להיווצרות APB, דבר המצביע על קיבוץ טלומר שאינו תלוי בכימיה של APB ונשען רק על נכס נוזלי APB11.
פרוטוקול זה הדגים היווצרות ופירוק של עיבויים בטלומרים עם מערכת עמעום כימית. קינטיקה של הפרדת פאזה ואשכול טלומר המושרה על ידי טיפה-היתוך מנוטרים באמצעות הדמיה חיה. לוקליזציה מרוכזת והרכב נקבעים עם דג DNA וחלבון IF.
קיימים שני שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. הראשון הוא לקבוע חלבון ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בארה”ב (1K22CA23763201 ל H.Z., GM118510 עד D.M.C.) וקרן צ’ארלס א. קאופמן ל- H.Z. המחברים רוצים להודות לג’ייסון טונס על הגהת כתב היד.
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | MT25053CI | |
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | Prepare 1% in 1x PBS |
6 Well Culture Plate | VWR | 10861-554 | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
Anti-mCherry antibody | Abcam | Ab183628 | |
Anti-PML antibody | Santa Cruz | sc966 | |
Anti-SUMO1 antibody | Abcam | Ab32058 | |
Anti-SUMO2/3 antibody | Cytoskeleton | Asm23 | |
Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
Circle Cover Slips | Thermo Scientific | 3350 | |
Confocal microscope | Nikon | MQS31000 | |
DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10017CV | |
EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Gibco | A4766801 | |
Formamide, Deionized | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
Laser merge module | Nikon | NIIMHF47180 | |
Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
Figure plotting software, MATLAB | The MathWorks | ||
Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
Nail Polish | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
Imaging software, NIS-Elements | Nikon | ||
Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 51985091 | |
Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
Penicillin-Streptomycin Solution,100X | Gibco | 15140122 | |
Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
Pipet Tips | VWR | 10017 | |
Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
Poly-D-Lysine solution | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
Sodium Azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
Spinning disk | Yokogawa | CSU-X1 | |
Square Cover Slips | Thermo Scientific | 3305 | |
TBS 10x solution | Fisher Scientific | BP2471500 | |
TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
TMP | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
TNH | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
Triton X-100 10% Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0.5% in 1x PBS |
U2Os cell line | From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |