テロメアの化学的二量体化誘導タンパク質凝縮物
Summary
このプロトコルは、クロマチン上に凝縮物を作製する化学的に誘導されたタンパク質二量体化システムを示す。 化学二量体を用いたテロメア上の前骨髄性白血病(PML)核体の形成が実証されている。液滴の成長、溶解、局在化および組成物は、生細胞イメージング、免疫蛍光(IF)および蛍光をその蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)でモニタリングする。
Abstract
クロマチン関連凝縮物は多くの核プロセスに関与しているが、根本的なメカニズムは依然として不可解である。このプロトコルは、テロメア上に凝縮物を作成するための化学的に誘導されたタンパク質二量体化システムを記述する。化学二量体は、それぞれタンパク質に結合できる2つの結合リガンドで構成されています: ハローリガンドからハロエンス酵素への結合とトリメトプリム (TMP) 大 腸菌 ジヒドロホウ酸還元酵素 (eDHFR) それぞれ).Halo酵素をテロメアタンパク質に融合させ、共有化Haloリガンド-酵素結合を介して二量体をテロメアに固定します。TMPとeDHFRの結合は、eDHFR融合相分離タンパク質をテロメアに採用し、凝縮物形成を誘導する。TMP-eDHFR相互作用は非共有化であるため、過剰なフリーTMPを使用してeDHFR結合のための二量体剤と競合することにより結露を逆転させることができる。テロメア上に前骨髄性白血病(PML)核体形成を誘導し、凝縮物の成長、溶解、局在化および組成物を決定する例が示される。この方法は、局所クロマチンに直接結合するタンパク質またはガイドRNAを用いてゲノム遺伝子座に標的とされるdCas9にHaloを融合させることにより、他のゲノム位置で凝縮物を誘導するように容易に適応することができる。生化学的アッセイのための細胞集団における相分離を維持しながら、単一細胞の生画像化に必要な時間分解能を提供することにより、クロマチン関連凝縮物の形成と機能の両方を調査するのに適しています。
Introduction
多くのタンパク質および核酸は、液体-液相分離(LLPS)を受け、生体分子凝縮物に自己集合して細胞1,2の生化学を組織する。クロマチン結合タンパク質のLLPSは、特異的ゲノム遺伝子座に関連する縮合物の形成を導き、様々な局所クロマチン機能3に関与している。例えば、HP1タンパク質のLLPSは、ゲノム4、5、転写因子のLLPSが転写センターを形成して転写センターを形成し、新生mRNAのLLPSおよび多セックスコームタンパク質がヒストン軌跡体を生成してヒストンmRNAの転写および処理を調節するヘテロクロマチンドメインの形成を基礎とする。 しかし、クロマチン関連凝縮物の多くの例が発見されているにもかかわらず、凝縮物形成、調節および機能の基礎的なメカニズムは依然として十分に理解されていない。特に、LLPSを介してすべてのクロマチン関連凝縮物が形成されるわけではないが、生細胞における凝縮物形成の慎重な評価は依然として8,9が必要である。例えば、マウスにおけるHP1タンパク質は、崩壊したポリマー球体10のように生きた細胞およびヘテロクロマチン病巣に液体液滴を形成する弱い能力しか持たなかった。したがって、生細胞におけるクロマチンにデノボ凝縮物を誘導するツールが望ましく、特に、生画像化および生化学的アッセイを使用して、凝縮物の動力学、結果として得られた凝縮物の物理的および化学的特性、および凝縮物形成の細胞の影響を監視することを可能にするものである。
このプロトコルは、クロマチン11 上のタンパク質凝縮物を誘導する化学二量体化システムを報告する(図1A)。二量体は、2つの結合されたタンパク質相互作用リガンドで構成されています:トリメトプリム(TMP)とハロリガンドと、同一受容体に融合したタンパク質を二量体化することができます: エシェリヒア・コリ ・ジヒドロホドロ葉酸還元酵素(eDHFR)と細菌アルキルデハロゲン酵素(Halo酵素)、それぞれ12。HaloリガンドとHalo酵素の相互作用は共有化されており、クロマチン結合タンパク質に融合させてクロマチン結合タンパク質に融合してクロマチンに融合した相分離タンパク質をクロマチンに融合させることで、Halo酵素をアンカーとして使用することができます。初期の募集後、相分離タンパク質の局所濃度の上昇は、相分離に必要な臨界濃度を通過し、したがってアンカーで凝縮物を核とする(図1B)。蛍光タンパク質(例えばmCherryやeGFP)をeDHFRとHaloに融合させることで、蛍光顕微鏡で凝縮物の核形成と成長をリアルタイムで可視化することができます。eDHFRとTMPの相互作用は非共有であるため、過剰な遊離TMPを添加して、eDHFR結合のための二量体剤と競合させることができる。これにより、アンカーから相分離タンパク質が放出され、クロマチン関連凝縮物が溶解します。
我々は、テロメア維持のためのテロメア(ALT)経路の代替長化を用いるテロメア(ALT)経路をテロメア維持13,14に対して、テロメア上のデノボ前骨髄球性白血病(PML)核体形成を誘導するためにこのツールを用いた。 PML核体は、多くの核プロセス15、16に関与する膜のないコンパートメントであり、ALTテロメアに固有に局在してAPBを形成し、ALTテロメア関連PML体17,18に対しては、ADBを形成する。テロメアは、ADB内に集結し、おそらくALT19で相同性指向テロメアDNA合成のための修復テンプレートを提供する。実際、テロメアDNA合成は、アペブで検出されており、ADBはテロメア20,21のDNA修復因子を豊かにする上で重要な役割を果たす。しかし、APBアセンブリとテロメアクラスタリングの基礎となるメカニズムは不明でした。ALT細胞のテロメアタンパク質はユビキチン様修飾(SMO)22によって一意に修飾されるため、多くのAPB成分は相総化部位22、23、24、25および/またはSUMO-を含む 相互作用モチーフ(SIM)26、27およびSUMO-SIM相互作用は相分離を促進する28を駆動し、テロメアの相化はタンパク質およびタンパク質を含むSUMO/SIMの濃縮につながると仮定したこれらのタンパク質間のSUMO-SIM相互作用は、相分離につながります。 3つの相総化サイトと1つのSIMサイトを有するPMLタンパク質を集結したテロメアを集結させてADBを形成し、液体ABの合体がテロメアクラスタリングにつながる。この仮説を検証するために、我々は、化学二量体化システムを用いて、SIMをテロメアに採用して相相化誘導APB形成を模倣した(図2A)11。GFPは、可視化のためにハロエンザイムに融合し、テロメア結合タンパク質TRF1に融合して二量化器をテロメアに固定します。SIMはeDHFRとmCherryに融合しています。凝縮体形成および液滴融合誘発テロメアクラスタリングの動態は、生細胞イメージングに続く。 相分離は、eDHFR結合と競合するために過剰な遊離TMPを添加することによって逆転する。蛍光免疫(IF)および蛍光をその蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)で使用して、凝縮体組成およびテロメリック会合を決定する。SIMを採用すると、テロメアでSUMOが豊かになり、誘導凝縮物にはPMLが含まれているため、ADBです。SUMOと相互作用できないSIM変異体を採用しても、相素体上でのSUMOの充実や相分離の誘導は行わないため、APB結露の基本的な原動力はSUMO-SIM相互作用であることを示しています。この観察に同意すると、TRF2結合因子RAP1に融合したポリスミオポリSIMポリマーも、APB形成29を誘導し得る。相分離が十分なタンパク質が生成される限り、相分離が起こるポリSUMO-polySIM融合システムと比較して、ここで提示される化学二量化アプローチは、オンデマンドで相分離を誘導し、したがって、相分離およびテロメアクラスタリングプロセスの運動を監視するより良い時間分解能を提供する。さらに、この化学二量体化システムは、相分離およびテロメアクラスタリングを誘導する能力を評価するために他のタンパク質の採用を可能にする。例えば、テロメアに採用された無秩序なタンパク質は、APB形成を誘発することなく液滴およびクラスターテロメアを形成することもできるが、テロメアクラスタリングはAPB化学から独立しており、APB液体特性11のみに依存することを示唆している。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、化学二量体化システムを用いたテロメア上の凝縮物の形成と溶解を実証した。相分離および液滴融合誘発テロメアクラスタリングのキネティクスは、ライブイメージングで監視されます。凝縮物の局在および組成は、DNA FISHおよびプロテインIFで決定される。
このプロトコルには 2 つの重要な手順があります。1つ目は、タンパク質および二量体濃度を…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国国立衛生研究所(1K22CA23763201からH.Z.、GM118510からD.M.C.)、チャールズ・E・カウフマン財団からH.Z.に支援されました。著者たちは、原稿を校正してくれたジェイソン・トーンズに感謝したいと思います。
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | MT25053CI | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | Prepare 1% in 1x PBS |
| 6 Well Culture Plate | VWR | 10861-554 | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anti-mCherry antibody | Abcam | Ab183628 | |
| Anti-PML antibody | Santa Cruz | sc966 | |
| Anti-SUMO1 antibody | Abcam | Ab32058 | |
| Anti-SUMO2/3 antibody | Cytoskeleton | Asm23 | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| Circle Cover Slips | Thermo Scientific | 3350 | |
| Confocal microscope | Nikon | MQS31000 | |
| DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10017CV | |
| EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Gibco | A4766801 | |
| Formamide, Deionized | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Laser merge module | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
| Figure plotting software, MATLAB | The MathWorks | ||
| Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
| Nail Polish | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| Imaging software, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution,100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Pipet Tips | VWR | 10017 | |
| Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Poly-D-Lysine solution | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Spinning disk | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x solution | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| TNH | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0.5% in 1x PBS |
| U2Os cell line | From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
References
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