Chemische Dimerisierungsinduzierte Proteinkondensate auf Telomeren
Summary
Dieses Protokoll veranschaulicht ein chemisch induziertes Proteindimerisierungssystem, um Kondensate auf Chromatin zu erzeugen. Die Bildung des Kernkörpers der promyelozytären Leukämie (PML) an Telomeren mit chemischen Dimerisatoren wird nachgewiesen. Tröpfchenwachstum, Auflösung, Lokalisation und Zusammensetzung werden mit Lebendzellbildgebung, Immunfluoreszenz (IF) und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) überwacht.
Abstract
Chromatin-assoziierte Kondensate sind an vielen Kernprozessen beteiligt, aber die zugrunde liegenden Mechanismen bleiben schwer fassbar. Dieses Protokoll beschreibt ein chemisch induziertes Proteindimerisierungssystem zur Herstellung von Kondensaten auf Telomeren. Der chemische Dimerizer besteht aus zwei verknüpften Liganden, die jeweils an ein Protein binden können: Halo-Ligand an Halo-Enzym und Trimethoprim (TMP) an E. coli dihydrofolat-Reduktase (eDHFR). Die Fusion des Halo-Enzyms zu einem Telomerprotein verankert Dimerizer an Telomeren durch kovalente Halo-Liganden-Enzymbindung. Die Bindung von TMP an eDHFR rekrutiert eDHFR-fusionierte Phasen, die Proteine an Telomere trennen und die Kondensatbildung induziert. Da die TMP-eDHFR-Wechselwirkung nicht kovalent ist, kann die Kondensation umgekehrt werden, indem überschüssiges freies TMP verwendet wird, um mit dem Dimerizer um die eDHFR-Bindung zu konkurrieren. Ein Beispiel für die Induktion der Kernkörperbildung von promyelozytärer Leukämie (PML) auf Telomeren und die Bestimmung von Kondensatwachstum, Auflösung, Lokalisation und Zusammensetzung wird gezeigt. Diese Methode kann leicht angepasst werden, um Kondensate an anderen genomischen Stellen zu induzieren, indem Halo zu einem Protein verschmiert wird, das direkt an das lokale Chromatin bindet, oder an dCas9, das mit einer Leit-RNA auf den genomischen Locus abzielt. Durch die Zeitauflösung, die für die Einzelzell-Live-Bildgebung erforderlich ist, während die Phasentrennung in einer Zellpopulation für biochemische Assays aufrechterhalten wird, eignet sich diese Methode sowohl für die Untersuchung der Bildung als auch der Funktion von Chromatin-assoziierten Kondensaten.
Introduction
Viele Proteine und Nukleinsäuren durchlaufen eine Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) und setzen sich selbst zu biomolekularen Kondensaten zusammen, um die Biochemie in den Zellen1,2zu organisieren. LLPS von Chromatin-bindenden Proteinen führt zur Bildung von Kondensaten, die mit spezifischen genomischen Loci assoziiert sind und an verschiedenen lokalen Chromatinfunktionen beteiligt sind3. Zum Beispiel liegt LLPS des HP1-Proteins der Bildung von Heterochromatindomänen zugrunde, um das Genom zu organisieren4,5, LLPS von Transkriptionsfaktoren bildet Transkriptionszentren zur Regulierung der Transkription6, LLPS von entstehenden mRNAs und multisexuellem Kämmprotein erzeugt Histon-Locus-Körper, um die Transkription und Verarbeitung von Histon-mRNAs zu regulieren7. Trotz vieler Beispiele für chromatin-assoziierte Kondensate sind die zugrunde liegenden Mechanismen der Kondensatbildung, -regulierung und -funktion jedoch nach wie vor wenig verstanden. Insbesondere werden nicht alle Chromatin-assoziierten Kondensate durch LLPS gebildet und sorgfältige Auswertungen der Kondensatbildung in lebenden Zellen sind noch erforderlich8,9. Zum Beispiel wird gezeigt, dass HP1-Protein in der Maus nur eine schwache Fähigkeit hat, flüssige Tröpfchen in lebenden Zellen zu bilden, und Heterochromatinherde verhalten sich wie kollabierte Polymerkügelchen10. Daher sind Werkzeuge zur Induktion von De-novo-Kondensaten auf Chromatin in lebenden Zellen wünschenswert, insbesondere solche, die die Verwendung von Live-Imaging und biochemischen Assays ermöglichen, um die Kinetik der Kondensatbildung, die physikalischen und chemischen Eigenschaften der resultierenden Kondensate und die zellulären Folgen der Kondensatbildung zu überwachen.
Dieses Protokoll berichtet von einem chemischen Dimerisierungssystem, um Proteinkondensate auf Chromatin11 zu induzieren (Abbildung 1A). Der Dimerizer besteht aus zwei miteinander verbundenen protein-interagierenden Liganden: Trimethoprim (TMP) und Halo-Ligand und kann Proteine dimerisieren, die mit den verwandten Rezeptoren verschmolzen sind: Escherichia coli dihydrofolat-Reduktase (eDHFR) und ein bakterielles Alkyldehalogenase-Enzym (Halo-Enzym), jeweils12. Die Interaktion zwischen Halo-Ligand und Halo-Enzym ist kovalent, so dass das Halo-Enzym als Anker verwendet werden kann, indem es mit einem Chromatin-bindenden Protein verschmolzen wird, um ein phasenseparierendes Protein zu rekrutieren, das mit eDHFR zu Chromatin verschmolzen ist. Nach der anfänglichen Rekrutierung übergibt eine erhöhte lokale Konzentration des phasenseparierenden Proteins die für die Phasentrennung erforderliche kritische Konzentration und keimt somit ein Kondensat am Anker ein (Abbildung 1B). Durch die Verschmelzung fluoreszierender Proteine (z.B. mCherry und eGFP) zu eDHFR und Halo können Keimbildung und Wachstum von Kondensaten in Echtzeit mit Fluoreszenzmikroskopie visualisiert werden. Da die Interaktion zwischen eDHFR und TMP nicht kovalent ist, kann überschüssiges freies TMP hinzugefügt werden, um mit dem Dimerizer für die eDHFR-Bindung zu konkurrieren. Dadurch wird dann das Phasentrennprotein aus dem Anker freisenden und das Chromatin-assoziierte Kondensat gelöst.
Wir haben dieses Werkzeug verwendet, um die De novo promyelozytäre Leukämie (PML) Kernkörperbildung auf Telomeren in Telomeren in Telomerase-negativen Krebszellen zu induzieren, die einen alternativen Verlängerungsweg der Telomere (ALT) für die Telomererhaltung verwenden13,14. PML-Kernkörper sind membranlose Kompartimente, die an vielen Kernprozessen beteiligt sind15,16 und sind einzigartig auf ALT-Telomere lokalisiert, um APBs zu bilden, für ALT-Telomer-assoziierte PML-Körper17,18. Telomere clustern sich innerhalb von APBs, vermutlich um Reparaturvorlagen für die homologiegerichtete Telomer-DNA-Synthese in ALT19bereitzustellen. Tatsächlich wurde die Telomer-DNA-Synthese in APBs nachgewiesen und APBs spielen eine wesentliche Rolle bei der Anreicherung von DNA-Reparaturfaktoren auf Telomeren20,21. Die Mechanismen, die der APB-Assemblierung und dem Telomer-Clustering innerhalb von APBs zugrunde liegen, waren jedoch unbekannt. Da Telomerproteine in ALT-Zellen durch kleine Ubiquitin-ähnliche Modifikatoren (SUMOs)22eindeutig modifiziert werden, viele APB-Komponenten Sumoylierungsstellen 22,23,24,25 und/oder SUMO-interagierende Motive (SIMs)26,27 und SUMO-SIM-Wechselwirkungen die Phasentrennung28antreiben, haben wir die Hypothese aufgestellt, dass die Sumoylation auf Telomeren zur Anreicherung von SUMO/SIM-haltigen Proteinen führt und SUMO-SIM-Wechselwirkungen zwischen diesen Proteinen führen zur Phasentrennung. PML-Protein, das drei Sumoylationsstellen und eine SIM-Stelle hat, kann zu sumoylierten Telomeren rekrutiert werden, um APBs zu bilden, und die Koaleszenz flüssiger APBs führt zu Telomerclustern. Um diese Hypothese zu testen, verwendeten wir das chemische Dimerisierungssystem, um die sumoylationsinduzierte APB-Bildung nachzuahmen, indem sim zu Telomeren rekrutiert wurde (Abbildung 2A)11. GFP wird zur Visualisierung mit Haloenzym und mit dem Telomer-bindenden Protein TRF1 verschmolzen, um den Dimerizer an Telomeren zu verankern. SIM ist mit eDHFR und mCherry verschmolzen. Die Kinetik der Kondensatbildung und die durch Tröpfchenfusion induzierte Telomerclusterung werden mit der Bildgebung von lebenden Zellen verfolgt. Die Phasentrennung wird durch Zugabe von überschüssigem freiem TMP umgekehrt, um mit der eDHFR-Bindung zu konkurrieren. Immunfluoreszenz (IF) und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) werden verwendet, um die Kondensatzusammensetzung und die telomerische Assoziation zu bestimmen. Recruiting SIM reichert SUMO auf Telomere an und die induzierten Kondensate enthalten PML und sind daher APBs. Die Rekrutierung einer SIM-Mutante, die nicht mit SUMO interagieren kann, reichert SUMO nicht an Telomeren an oder induziert keine Phasentrennung, was darauf hindeutet, dass die grundlegende treibende Kraft für die APB-Kondensation die SUMO-SIM-Interaktion ist. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung können PolySUMO-PolySIM-Polymere, die mit einem TRF2-Bindungsfaktor RAP1 verschmolzen sind, auch die APB-Bildung29induzieren. Im Vergleich zum polySUMO-polySIM-Fusionssystem, bei dem die Phasentrennung erfolgt, solange genügend Proteine produziert werden, induziert der hier vorgestellte chemische Dimerisierungsansatz die Phasentrennung bei Bedarf und bietet somit eine bessere zeitliche Auflösung, um die Kinetik der Phasentrennung und des Telomerclustering-Prozesses zu überwachen. Darüber hinaus ermöglicht dieses chemische Dimerisierungssystem die Rekrutierung anderer Proteine, um ihre Fähigkeit zur Induktion von Phasentrennung und Telomerclustering zu bewerten. Zum Beispiel kann ein ungeordnetes Protein, das zu Telomeren rekrutiert wird, auch Tröpfchen und Cluster-Telomere bilden, ohne die APB-Bildung zu induzieren, was darauf hindeutet, dass die Telomerclusterung unabhängig von der APB-Chemie ist und nur auf der APB-Flüssigkeitseigenschaft11beruht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll demonstrierte die Bildung und Auflösung von Kondensaten auf Telomeren mit einem chemischen Dimerisierungssystem. Die Kinetik der Phasentrennung und das durch die Tröpfchenfusion induzierte Telomerclustering werden mit Live-Bildgebung überwacht. Kondensatlokalisierung und -zusammensetzung werden mit DNA FISH und Protein IF bestimmt.
Es gibt zwei kritische Schritte in diesem Protokoll. Die erste besteht darin, die Protein- und Dimerizerkonzentration zu bestimmen. Der Erfolg b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von US National Institutes of Health (1K22CA23763201 bis H.Z., GM118510 bis D.M.C.) und Charles E. Kaufman Foundation bis H.Z. Die Autoren danken Jason Tones für das Korrekturlesen des Manuskripts.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | MT25053CI | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | Prepare 1% in 1x PBS |
| 6 Well Culture Plate | VWR | 10861-554 | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anti-mCherry antibody | Abcam | Ab183628 | |
| Anti-PML antibody | Santa Cruz | sc966 | |
| Anti-SUMO1 antibody | Abcam | Ab32058 | |
| Anti-SUMO2/3 antibody | Cytoskeleton | Asm23 | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| Circle Cover Slips | Thermo Scientific | 3350 | |
| Confocal microscope | Nikon | MQS31000 | |
| DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10017CV | |
| EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Gibco | A4766801 | |
| Formamide, Deionized | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Laser merge module | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
| Figure plotting software, MATLAB | The MathWorks | ||
| Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
| Nail Polish | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| Imaging software, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution,100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Pipet Tips | VWR | 10017 | |
| Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Poly-D-Lysine solution | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Spinning disk | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x solution | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| TNH | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0.5% in 1x PBS |
| U2Os cell line | From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
References
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