الكشف عن الجليكوسامينوغليكان بواسطة البولي أكريلاميد جل إلكتروفورسيس وتلطيخ الفضة
Summary
يصف هذا التقرير تقنيات عزل وتنقية الجليكوسامينوغليكانات الكبريتية (GAGs) من العينات البيولوجية ونهج إلكتروفورسيس هلام البولي أكريلاميد لتقريب حجمها. تساهم GAGs في بنية الأنسجة والتأثير على عمليات الإشارات عبر التفاعل الكهروستاتيكي مع البروتينات. يساهم طول البوليمر GAG في تقاربها الملزم للليجانات cognate.
Abstract
الكبريتات الجليكوسامينوغليكان (GAGs) مثل كبريتات الهيباران (HS) وكبريتات شوندرويتين (CS) موجودة في كل مكان في الكائنات الحية وتلعب دورا حاسما في مجموعة متنوعة من الهياكل والعمليات البيولوجية الأساسية. كما البوليمرات، GAGs موجودة كخليط متعدد الأضلاع التي تحتوي على سلاسل البوليساكريد التي يمكن أن تتراوح بين 4000 دا إلى أكثر من 40،000 دا. داخل هذه السلاسل توجد مجالات الكبريت، مما يمنح نمطا من الشحنة السلبية التي تسهل التفاعل مع بقايا مشحونة إيجابيا من ليغند البروتين cognate. يجب أن تكون المجالات الكبريتية من GAGs من طول كاف للسماح لهذه التفاعلات الكهربائية. لفهم وظيفة GAGs في الأنسجة البيولوجية ، يجب أن يكون المحقق قادرا على عزل وتنقية وقياس حجم GAGs. يصف هذا التقرير تقنية عملية ومتعددة الاستخدامات تعتمد على جل البولي أكريلاميد تعتمد على الكهروفورسيس والتي يمكن الاستفادة منها لحل الاختلافات الصغيرة نسبيا في الحجم بين GAGs المعزولة عن مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة البيولوجية.
Introduction
الجليكوسامينوغليكان (GAGs) هي عائلة متنوعة من السكريات الخطية التي هي عنصر في كل مكان في الكائنات الحية وتساهم في العديد من العمليات الفسيولوجية الأساسية1. ويمكن كبريتات GAGs مثل كبريتات الهيباران (HS) وكبريتات شوندرويتين (CS) في مواقع متميزة على طول سلسلة البوليساكريد ، مما يضفي مجالات جغرافية من الشحنة السلبية. هذه GAGs، عندما المربوطة إلى البروتينات سطح الخلية المعروفة باسم البروتيوغليكان، المشروع في الفضاء خارج الخلية وربط ليغاندس cognate، مما يسمح لتنظيم كل من رابطة الدول المستقلة- (ligand تعلق على نفس الخلية) وعبر -(ligand تعلق على الخلية المجاورة) عمليات الإشارة2. وعلاوة على ذلك، GAGs أيضا أداء الأدوار الحاسمة كعناصر هيكلية في الأنسجة مثل غشاء الطابق السفلي الكبيبي3،والغليكولايل البطانيةالوعائية 4 والظهارية الرئوية الجليكوكاليك5،وفي الأنسجة الضامة مثل الغضاريف6.
يختلف طول سلاسل الكمامات متعددة الشاريد بشكل كبير وفقا لسياقها البيولوجي ويمكن إطالته بشكل ديناميكي ، وتكبيله ، وتعديله بواسطة نظام تنظيمي أنزيمي معقد للغاية7. الأهم من ذلك ، فإن طول سلاسل البوليمر GAG يساهم بشكل كبير في تقاربها الملزم للليجاند ، وبالتالي ، إلى وظيفتها البيولوجية8،9. ولهذا السبب، فإن تحديد وظيفة GAG الداخلي يتطلب تقديرا لحجمها. لسوء الحظ ، على عكس البروتينات والأحماض النووية ، لا يوجد سوى عدد قليل جدا من التقنيات المتاحة بسهولة للكشف عن GAGs وقياسها ، مما أدى تاريخيا إلى تحقيق محدود نسبيا في الأدوار البيولوجية لهذه العائلة المتنوعة من السكريات المتعددة.
توضح هذه المقالة كيفية عزل وتنقية GAGs من معظم الأنسجة البيولوجية ، وتصف أيضا كيفية استخدام البولي أكريلاميد هلام electrophoresis (PAGE) لتقييم طول البوليمرات المعزولة بدرجة معقولة من التحديد. وعلى النقيض من النهج الجليكومية الأخرى البالغة التعقيد (والتي غالبا ما تكون قائمة على قياس الطيف الكتلي)، يمكن استخدام هذه الطريقة باستخدام معدات وتقنيات مختبرية قياسية. ولذلك، فإن هذا النهج العملي قد يوسع قدرة المحققين على تحديد الدور البيولوجي لغاغس الأصلية وتفاعلها مع الليجاندات ذات الأهمية السياقية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تلعب مجموعات GAGs دورا مركزيا في العديد من العمليات البيولوجية المتنوعة. واحدة من الوظائف الرئيسية لغاغات كبريتات (مثل HS و CS) هو التفاعل مع وربط ليغاندس، والتي يمكن أن تغير وظائف الإشارات المصب. محدد مهم لتقارب GAG ملزمة لgnate ligands هو طول سلسلة البوليمر GAG 8،9،</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل F31 HL143873-01 (WBL) ، R01 HL125371 (RJL و EPS)
Materials
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
- LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
- Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).
- Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).
- Haeger, S. M., et al. Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury. American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).
- Mankin, H. J., Lippiello, L. The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage. Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).
- Annaval, T., et al. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity. Molecules. 25 (18), (2020).
- Zhang, F., et al. Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans. Molecules. 24 (18), (2019).
- Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors. Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).
- Cowman, M. K., et al. Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides. Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).
- Møller, H. J., Poulsen, J. H. Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).
- Min, H., Cowman, M. K. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).
- Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes. Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).
- Abraham, E., et al. Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group. Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).
- Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity. Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).
- Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography. Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).
- Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review. Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).
- Whiteman, P. The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes. Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).
- Yuan, H., et al. Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein. Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).
