Detecção de glicosaminoglicanos por Electrophoresis gel poliacrilamida e coloração de prata
Summary
Este relatório descreve técnicas para isolar e purificar glicosaminoglycanos sulfatos (GAGs) de amostras biológicas e uma abordagem de eletroforese de gel de poliacrilamida para aproximar seu tamanho. Os GAGs contribuem para a estrutura tecidual e influenciam os processos de sinalização através da interação eletrostática com proteínas. O comprimento do polímero GAG contribui para sua afinidade vinculante para ligantes cognatos.
Abstract
Glicosaminoglicanos sulfatos (GAGs) como sulfato de heparan (HS) e sulfato de condroitina (CS) são onipresentes em organismos vivos e desempenham um papel crítico em uma variedade de estruturas e processos biológicos básicos. Como polímeros, os GAGs existem como uma mistura de polidisperse contendo cadeias de polissacarídeos que podem variar de 4000 Da a bem mais de 40.000 Da. Dentro dessas cadeias existem domínios de sulfatação, conferindo um padrão de carga negativa que facilita a interação com resíduos carregados positivamente de ligantes proteicos cognatos. Os domínios sul-americanos dos GAGs devem ter comprimento suficiente para permitir essas interações eletrostáticas. Para entender a função dos GAGs em tecidos biológicos, o pesquisador deve ser capaz de isolar, purificar e medir o tamanho dos GAGs. Este relatório descreve uma técnica prática e versátil baseada em gel de poliacrilamida baseada em eletroforese que pode ser aproveitada para resolver diferenças relativamente pequenas de tamanho entre GAGs isolados de uma variedade de tipos de tecidos biológicos.
Introduction
Os glicosaminoglicanos (GAGs) são uma família diversificada de polissacarídeos lineares que são um elemento onipresente em organismos vivos e contribuem para muitos processos fisiológicos básicos1. GaGs como sulfato de heparan (HS) e sulfato de condroitina (CS) podem ser sulfatados em posições distintas ao longo da cadeia de polissacarídeos, transmitindo domínios geográficos de carga negativa. Esses GAGs, quando amarrados a proteínas da superfície celular conhecidas como proteoglycans, projetam-se no espaço extracelular e se ligam a ligantes cognatos, permitindo a regulação tanto dos processos de sinalização cis- (ligantes ligados à mesma célula) quanto trans( ligantes ligados à célula vizinha) processos de sinalização2. Além disso, os GAGs também desempenham papéis críticos como elementos estruturais em tecidos como a membrana glomerular do porão3,o glicocalyx endotelial vascular4 e a glicocalyx epitelialpulmonar 5, e em tecidos conjuntivos tais cartilagem6.
O comprimento das cadeias de polissacarídeos GAG varia substancialmente de acordo com seu contexto biológico e pode ser dinamicamente alongado, cortado e modificado por um sistema regulatório enzimático altamente complexo7. É importante ressaltar que o comprimento das cadeias de polímeros GAG contribui substancialmente para sua afinidade vinculante com ligantes e, posteriormente, para sua função biológica8,9. Por essa razão, a determinação da função de um GAG endógeno requer a valorização de seu tamanho. Infelizmente, ao contrário de proteínas e ácidos nucleicos, existem muito poucas técnicas prontamente disponíveis para detectar e medir GAGs, o que historicamente resultou em uma investigação relativamente limitada sobre os papéis biológicos desta diversificada família polissacarídeo.
Este artigo descreve como isolar e purificar GAGs da maioria dos tecidos biológicos, e, também, descreve como usar a eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) para avaliar o comprimento dos polímeros isolados com um grau justo de especificidade. Em contraste com outras abordagens glicomicicas altamente complexas (e muitas vezes baseadas em espectrometria de massa), este método pode ser empregado usando equipamentos e técnicas de laboratório padrão. Essa abordagem prática pode, portanto, expandir a capacidade dos investigadores de determinar o papel biológico dos GAGs nativos e sua interação com ligantes contextualmente importantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os GAGs desempenham um papel central em muitos processos biológicos diversos. Uma das principais funções dos GAGs sulfatados (como HS e CS) é interagir e ligar-se aos ligantes, o que pode alterar as funções de sinalização a jusante. Um importante determinante da afinidade de ligação gag com ligantes cognatos é o comprimento da cadeia de polímeros GAG 8,9,14. Por essa razão, é importante que os pesquisadores possam …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL e EPS)
Materials
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
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