Rilevazione di glicosaminoglicani mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide e colorazione dell'argento
Summary
Questo rapporto descrive le tecniche per isolare e purificare i glicosaminoglicani solfati (GAG) da campioni biologici e un approccio di elettroforesi su gel di poliacrilammide per approssimarne le dimensioni. I GAG contribuiscono alla struttura dei tessuti e influenzano i processi di segnalazione attraverso l’interazione elettrostatica con le proteine. La lunghezza del polimero GAG contribuisce alla loro affinità di legame per i ligandi affini.
Abstract
I glicosaminoglicani solfati (GAG) come l’eparina solfato (HS) e il solfato di condroitina (CS) sono onnipresenti negli organismi viventi e svolgono un ruolo fondamentale in una varietà di strutture e processi biologici di base. Come polimeri, i GAG esistono come una miscela polidispersa contenente catene di polisaccaridi che possono variare da 4000 Da a ben oltre 40.000 Da. All’interno di queste catene esistono domini di solfatazione, che conferiscono un modello di carica negativa che facilita l’interazione con residui caricati positivamente di ligandi proteici affini. I domini solfatati dei GAG devono essere di lunghezza sufficiente per consentire queste interazioni elettrostatiche. Per comprendere la funzione dei GAG nei tessuti biologici, lo sperimentatore deve essere in grado di isolare, purificare e misurare le dimensioni dei GAG. Questo rapporto descrive una tecnica pratica e versatile basata sull’elettroforesi su gel di poliacrilammide che può essere sfruttata per risolvere differenze di dimensioni relativamente piccole tra i GAG isolati da una varietà di tipi di tessuto biologico.
Introduction
I glicosaminoglicani (GAG) sono una famiglia diversificata di polisaccaridi lineari che sono un elemento onnipresente negli organismi viventi e contribuiscono a molti processi fisiologici di base1. GAG come eparina solfato (HS) e condroitin solfato (CS) possono essere solfatati in posizioni distinte lungo la catena dei polisaccaridi, impartendo domini geografici di carica negativa. Questi GAG, quando legati a proteine della superficie cellulare note come proteoglicani, si proiettano nello spazio extracellulare e si legano a ligandi affini, consentendo la regolazione dei processi di segnalazione cis- (ligando attaccato alla stessa cellula) e trans- (ligando attaccato alla cellula vicina)2. Inoltre, i GAG svolgono anche ruoli critici come elementi strutturali in tessuti come la membrana basale glomerulare3,il glicocalyx4 endoteliale vascolare e il glicocalyx epiteliale polmonare5e nei tessuti connettivi come la cartilagine6.
La lunghezza delle catene di polisaccaridi GAG varia sostanzialmente a seconda del suo contesto biologico e può essere dinamicamente allungata, scissa e modificata da un sistema di regolazione enzimatico altamente complesso7. È importante sottolineare che la lunghezza delle catene polimeriche GAG contribuisce in modo sostanziale alla loro affinità di legame per i ligandi e, successivamente, alla loro funzione biologica8,9. Per questo motivo, la determinazione della funzione di un GAG endogeno richiede l’apprezzamento delle sue dimensioni. Sfortunatamente, a differenza delle proteine e degli acidi nucleici, esistono pochissime tecniche prontamente disponibili per rilevare e misurare i GAG, il che ha storicamente portato a un’indagine relativamente limitata sui ruoli biologici di questa diversa famiglia di polisaccaridi.
Questo articolo descrive come isolare e purificare i GAG dalla maggior parte dei tessuti biologici e, inoltre, descrive come utilizzare l’elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) per valutare la lunghezza dei polimeri isolati con un discreto grado di specificità. A differenza di altri approcci glicemici altamente complessi (e spesso basati sulla spettrometria di massa), questo metodo può essere impiegato utilizzando apparecchiature e tecniche di laboratorio standard. Questo approccio pratico può, quindi, espandere la capacità degli investigatori di determinare il ruolo biologico dei GAG nativi e la loro interazione con ligandi contestualmente importanti.
Protocol
Representative Results
Discussion
I GAG svolgono un ruolo centrale in molti processi biologici diversi. Una delle funzioni principali dei GAG solfati (come HS e CS) è quella di interagire e legarsi ai ligandi, che possono alterare le funzioni di segnalazione a valle. Un importante determinante dell’affinità di legame GAG ai ligandi affini è la lunghezza della catena polimerica GAG 8,9,14. Per questo motivo, è importante che i ricercatori siano in grado di de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL ed EPS)
Materials
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
- LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
- Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).
- Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).
- Haeger, S. M., et al. Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury. American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).
- Mankin, H. J., Lippiello, L. The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage. Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).
- Annaval, T., et al. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity. Molecules. 25 (18), (2020).
- Zhang, F., et al. Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans. Molecules. 24 (18), (2019).
- Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors. Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).
- Cowman, M. K., et al. Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides. Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).
- Møller, H. J., Poulsen, J. H. Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).
- Min, H., Cowman, M. K. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).
- Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes. Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).
- Abraham, E., et al. Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group. Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).
- Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity. Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).
- Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography. Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).
- Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review. Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).
- Whiteman, P. The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes. Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).
- Yuan, H., et al. Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein. Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).
