Nachweis von Glykosaminoglykanen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Silberfärbung
Summary
Dieser Bericht beschreibt Techniken zur Isolierung und Reinigung von sulfatierten Glykosaminoglykanen (GAGs) aus biologischen Proben und einen Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Ansatz, um ihre Größe anzunähern. GAGs tragen zur Gewebestruktur bei und beeinflussen Signalprozesse durch elektrostatische Interaktion mit Proteinen. Die GAG-Polymerlänge trägt zu ihrer Bindungsaffinität für verwandte Liganden bei.
Abstract
Sulfatierte Glykosaminoglykane (GAGs) wie Heparansulfat (HS) und Chondroitinsulfat (CS) sind in lebenden Organismen allgegenwärtig und spielen eine entscheidende Rolle in einer Vielzahl grundlegender biologischer Strukturen und Prozesse. Als Polymere existieren GAGs als polydisperse Mischung, die Polysaccharidketten enthält, die von 4000 Da bis weit über 40.000 Da reichen können. Innerhalb dieser Ketten existieren Domänen der Sulfatierung, die ein Muster negativer Ladung verleihen, das die Interaktion mit positiv geladenen Rückständen verwandter Proteinliganden erleichtert. Sulfatierte Domänen von GAGs müssen eine ausreichende Länge haben, um diese elektrostatischen Wechselwirkungen zu ermöglichen. Um die Funktion von GAGs in biologischen Geweben zu verstehen, muss der Prüfer in der Lage sein, die Größe von GAGs zu isolieren, zu reinigen und zu messen. Dieser Bericht beschreibt eine praktische und vielseitige Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese-basierte Technik, die genutzt werden kann, um relativ kleine Größenunterschiede zwischen GAGs zu lösen, die aus einer Vielzahl von biologischen Gewebetypen isoliert wurden.
Introduction
Glykosaminoglykane (GAGs) sind eine vielfältige Familie linearer Polysaccharide, die ein allgegenwärtiges Element in lebenden Organismen sind und zu vielen grundlegenden physiologischen Prozessen beitragen1. GAGs wie Heparansulfat (HS) und Chondroitinsulfat (CS) können an verschiedenen Positionen entlang der Polysaccharidkette sulfatiert werden, wodurch geografische Domänen negativer Ladung entstehen. Diese GAGs, wenn sie an Zelloberflächenproteine gebunden sind, die als Proteoglykane bekannt sind, projizieren in den extrazellulären Raum und binden an verwandte Liganden, was die Regulation sowohl der cis- (Liganden, der an dieselbe Zelle gebunden ist) als auch der trans- (Liganden, die an benachbarte Zellen gebunden sind) Signalprozesse ermöglichen2. Darüber hinaus spielen GAGs auch eine kritische Rolle als Strukturelemente in Geweben wie der glomerulären Basalmembran3,dem vaskulären endothelialen Glycocalyx4 und dem pulmonalen epithelialen Glycocalyx5und in Bindegeweben wie Knorpel6.
Die Länge von GAG-Polysaccharidketten variiert je nach biologischem Kontext erheblich und kann durch ein hochkomplexes enzymatisches Regulationssystem dynamisch verlängert, gespalten und modifiziert werden7. Wichtig ist, dass die Länge der GAG-Polymerketten wesentlich zu ihrer Bindungsaffinität für Liganden und anschließend zu ihrer biologischen Funktion beiträgt8,9. Aus diesem Grund erfordert die Bestimmung der Funktion eines endogenen GAG eine Wertschätzung seiner Größe. Leider gibt es im Gegensatz zu Proteinen und Nukleinsäuren nur sehr wenige leicht verfügbare Techniken zum Nachweis und zur Messung von GAGs, was in der Vergangenheit zu einer relativ begrenzten Untersuchung der biologischen Rollen dieser vielfältigen Polysaccharidfamilie geführt hat.
Dieser Artikel beschreibt, wie GAGs aus den meisten biologischen Geweben isoliert und reinigt werden, und beschreibt auch, wie man Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) verwendet, um die Länge der isolierten Polymere mit einem angemessenen Grad an Spezifität zu bewerten. Im Gegensatz zu anderen, hochkomplexen (und oft massenspektrometrischen) glykomischen Ansätzen kann diese Methode mit Standardlaborgeräten und -techniken eingesetzt werden. Dieser praktische Ansatz könnte daher die Fähigkeit der Forscher erweitern, die biologische Rolle nativer GAGs und ihre Interaktion mit kontextuell wichtigen Liganden zu bestimmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
GAGs spielen eine zentrale Rolle in vielen verschiedenen biologischen Prozessen. Eine der Hauptfunktionen von sulfatierten GAGs (wie HS und CS) besteht darin, mit Liganden zu interagieren und an sie zu binden, was die nachgeschalteten Signalfunktionen verändern kann. Eine wichtige Determinante der GAG-Bindungsaffinität zu verwandten Liganden ist die Länge der GAG-Polymerkette 8,9,14. Aus diesem Grund ist es wichtig, dass Fors…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde gefördert durch F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL und EPS)
Materials
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
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