Detección de glicosaminoglicanos por electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción de plata
Summary
Este informe describe técnicas para aislar y purificar glicosaminoglicanos sulfatados (GAG) a partir de muestras biológicas y un enfoque de electroforesis en gel de poliacrilamida para aproximarse a su tamaño. Los GAG contribuyen a la estructura de los tejidos e influyen en los procesos de señalización a través de la interacción electrostática con las proteínas. La longitud del polímero GAG contribuye a su afinidad de unión por los ligandos cognados.
Abstract
Los glicosaminoglicanos sulfatados (GAG) como el sulfato de heparán (HS) y el sulfato de condroitina (CS) son omnipresentes en los organismos vivos y desempeñan un papel crítico en una variedad de estructuras y procesos biológicos básicos. Como polímeros, los GAG existen como una mezcla polidispersa que contiene cadenas de polisacáridos que pueden variar desde 4000 Da hasta más de 40,000 Da. Dentro de estas cadenas existen dominios de sulfatación, que confieren un patrón de carga negativa que facilita la interacción con residuos cargados positivamente de ligandos de proteínas cognadas. Los dominios sulfatados de los GAG deben tener una longitud suficiente para permitir estas interacciones electrostáticas. Para comprender la función de los GAG en los tejidos biológicos, el investigador debe ser capaz de aislar, purificar y medir el tamaño de los GAG. Este informe describe una técnica práctica y versátil basada en electroforesis en gel de poliacrilamida que se puede aprovechar para resolver diferencias relativamente pequeñas de tamaño entre los GAG aislados de una variedad de tipos de tejidos biológicos.
Introduction
Los glicosaminoglicanos (GAG) son una familia diversa de polisacáridos lineales que son un elemento ubicuo en los organismos vivos y contribuyen a muchos procesos fisiológicos básicos1. Los GAG como el sulfato de heparán (HS) y el sulfato de condroitina (CS) pueden ser sulfatados en posiciones distintas a lo largo de la cadena de polisacáridos, impartiendo dominios geográficos de carga negativa. Estos GAG, cuando están atados a proteínas de la superficie celular conocidas como proteoglicanos, se proyectan en el espacio extracelular y se unen a ligandos cognados, lo que permite la regulación de los procesos de señalización cis- (ligando unido a la misma célula) y trans- (ligando unido a la célula vecina)2. Además, los GAG también desempeñan funciones críticas como elementos estructurales en tejidos como la membrana basal glomerular3,el glicocáliz endotelial vascular4 y el glicocáliz epitelial pulmonar5,y en tejidos conectivos como el cartílago6.
La longitud de las cadenas de polisacáridos GAG varía sustancialmente según su contexto biológico y puede ser dinámicamente alargada, escindida y modificada por un sistema regulador enzimático altamente complejo7. Es importante destacar que la longitud de las cadenas de polímeros GAG contribuye sustancialmente a su afinidad de unión por los ligandos y, posteriormente, a su función biológica8,9. Por esta razón, la determinación de la función de un GAG endógeno requiere la apreciación de su tamaño. Desafortunadamente, a diferencia de las proteínas y los ácidos nucleicos, existen muy pocas técnicas fácilmente disponibles para detectar y medir los GAG, lo que históricamente ha resultado en una investigación relativamente limitada sobre los roles biológicos de esta diversa familia de polisacáridos.
Este artículo describe cómo aislar y purificar los GAG de la mayoría de los tejidos biológicos y, también, describe cómo usar la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) para evaluar la longitud de los polímeros aislados con un buen grado de especificidad. A diferencia de otros enfoques glucómicos altamente complejos (y a menudo basados en espectrometría de masas), este método se puede emplear utilizando equipos y técnicas de laboratorio estándar. Este enfoque práctico puede, por lo tanto, ampliar la capacidad de los investigadores para determinar el papel biológico de los GAG nativos y su interacción con ligandos contextualmente importantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los GAG desempeñan un papel central en muchos procesos biológicos diversos. Una de las principales funciones de los GAG sulfatados (como HS y CS) es interactuar y unirse a los ligandos, que pueden alterar las funciones de señalización aguas abajo. Un determinante importante de la afinidad de unión gag a los ligandos cognados es la longitud de la cadena de polímero GAG 8,9,14. Por esta razón, es importante que los investig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL y EPS)
Materials
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
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