تحديد التنفس الميتوكوندريا وتحلل الجليكوليسيس في عينات الأنسجة الشبكية Ex Vivo
Summary
وصف هنا هو بروتوكول مفصل لإجراء اختبار الإجهاد الميتوكوندريا ونسبة الجليكوليك المقايسة في عينات الأنسجة الشبكية في الجسم الحي السابق باستخدام تحليل حيوي التجارية.
Abstract
التنفس الميتوكوندريا هو مسار توليد الطاقة الحرجة في جميع الخلايا، وخاصة المستقبلات الضوئية الشبكية التي تمتلك عملية التمثيل الغذائي نشطة للغاية. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر المستقبلات الضوئية أيضا انحلال غليكوليسيس هوائي عالي مثل الخلايا السرطانية. يمكن أن توفر القياسات الدقيقة لهذه الأنشطة الأيضية رؤى قيمة في التوازن الخلوي في ظل الظروف الفسيولوجية وفي حالات المرض. وقد وضعت عالية الإنتاجية المقايسات المستندة إلى لوحة صغيرة لقياس التنفس الميتوكوندريا ومختلف الأنشطة الأيضية في الخلايا الحية. ومع ذلك، يتم تطوير الغالبية العظمى من هذه للخلايا المستزرعة ولم يتم تحسين لعينات الأنسجة سليمة والتطبيق السابق فيفو. وصف هنا هو مفصل خطوة بخطوة بروتوكول، وذلك باستخدام تكنولوجيا الفلورية القائمة على لوحة صغيرة، لقياس مباشرة معدل استهلاك الأكسجين (OCR) كمؤشر على التنفس الميتوكوندريا، فضلا عن معدل الحموضة خارج الخلية (ECAR) كمؤشر على انحلال الجليكوليسيس، في الأنسجة الشبكية السابقة سليمة . وقد استخدمت هذه الطريقة لتقييم بنجاح الأنشطة الأيضية في شبكية العين الماوس الكبار وإظهار تطبيقه في التحقيق في الآليات الخلوية للشيخوخة والمرض.
Introduction
الميتوكوندريا هي العضية الأساسية التي تنظم التمثيل الغذائي الخلوي، والإشارات، وداء التوازن، وموت الخلايا المبرمج من خلال تنسيق العمليات الفسيولوجية الحاسمة المتعددة1. الميتوكوندريا بمثابة قوة في الخلية لتوليد أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) من خلال الفوسفور التأكسدي (OXPHOS) وتوفير الطاقة التي تدعم تقريبا جميع الأحداث الخلوية. يتم استقلاب غالبية الأكسجين الخلوي في الميتوكوندريا ، حيث يعمل كمقبول الإلكترون النهائي في سلسلة نقل الإلكترون (ETC) أثناء التنفس الهوائي. يمكن أيضا إنتاج كميات منخفضة من ATP من انحلال الجليكوليس في السيتوسول ، حيث يتم تحويل الجلوكوز إلى بيروفاتي ، والتي يمكن تحويلها إلى لاكتات أو نقلها إلى الميتوكوندريا وتأكسدها إلى أسيتيل -CoA ، وهي ركيزة في دورة حمض الثلاثي (دورة TCA).
شبكية العين هي واحدة من الأنسجة الأكثر نشاطا الأيضية في الثدييات2، وعرض مستويات عالية من التنفس الميتوكوندريا واستهلاك الأكسجين عالية للغاية3. قضيب ومخروط مستقبلات ضوئية تحتوي على كثافة عالية من Mitochondria4، وOXPHOS يولد معظم ATP في شبكية العين5. بالإضافة إلى ذلك، تعتمد شبكية العين أيضا بشكل كبير على انحلال الجليكوليسيس الهوائي6,7 عن طريق تحويل الجلوكوز إلى لاكتات5. وترتبط عيوب الميتوكوندريا مع مختلف الأمراض العصبية8,9; ومع متطلباتها الفريدة من الطاقة العالية ، فإن شبكية العين معرضة بشكل خاص للعيوب الأيضية ، بما في ذلك تلك التي تؤثر على OXPHOS4 الميتوكوندريا وتحلل الجليكوليسيس10. الخلل الوظيفي الميتوكوندريا والعيوب في انحلال الجليكوليسيس متورطة في الشبكية111,12 والأمراض التنكسية البقعي13, الضمور البقعي المرتبط بالعمر10,14,15,16, واعتلال الشبكية السكري17,18. لذلك، يمكن أن توفر القياسات الدقيقة لتنفس الميتوكوندريا وتحلل الجليكوليسيس معايير مهمة لتقييم سلامة وصحة شبكية العين.
يمكن قياس تنفس الميتوكوندريا من خلال تحديد معدل استهلاك الأكسجين (OCR). وبالنظر إلى أن تحويل الجلوكوز إلى بيروفاتي وبالتالي إلى اللاكتات يؤدي إلى قذف البروتونات إلى البيئة خارج الخلية وتحمضها ، فإن قياسات معدل الحموضة خارج الخلية (ECAR) توفر مؤشرا على تدفق انحلال الجليكوليزي. كما تتكون شبكية العين من أنواع الخلايا المتعددة مع العلاقات الحميمة والتآزر النشط، بما في ذلك تبادل الركائز6، فمن الضروري لتحليل وظيفة الميتوكوندريا والتمثيل الغذائي في سياق أنسجة الشبكية بأكملها مع صفح سليمة والدوائر. على مدى العقود القليلة الماضية، تم استخدام أقطاب كلارك O2 وغيرها من الأقطاب الكهربائية الدقيقة الأكسجين لقياس استهلاك الأكسجين في شبكية العين19،20،21. هذه الأقطاب الأكسجين لديها قيود كبيرة في الحساسية، ومتطلبات حجم عينة كبيرة، والحاجة إلى التحريك المستمر للعينة تعليق، الأمر الذي يؤدي عادة إلى تعطيل السياق الخلوي والأنسجة. تم تطوير البروتوكول الموصوف هنا باستخدام تقنية مضان تعتمد على الألواح الدقيقة لقياس استقلاب الطاقة الميتوكوندريا في أنسجة شبكية العين السابقة للفأر السابق تشريحها حديثا. يسمح بقياسات متوسطة الإنتاجية في الوقت الحقيقي لكل من OCR و ECAR في وقت واحد باستخدام عينة صغيرة (لكمة 1 مم) من أنسجة الشبكية في الجسم الحي مع تجنب الحاجة إلى التعليق والتحريك المستمر.
أظهرت هنا هو الإجراء التجريبي لالقساء الإجهاد الميتوكوندريا ونسبة الجليكوليك المقايسة على أقراص لكمة الشبكية تشريح حديثا. يسمح هذا البروتوكول بقياس الأنشطة الأيضية المتعلقة بالميتوكوندريا في سياق الأنسجة الحية السابقة. تختلف عن المقايسات التي أجريت باستخدام الخلايا المستزرعة، والقراءات التي تم الحصول عليها هنا تعكس التمثيل الغذائي للطاقة مجتمعة على مستوى الأنسجة وتتأثر بالتفاعلات بين أنواع الخلايا المختلفة داخل الأنسجة. تم تعديل البروتوكول من الإصدار 22,23 المنشور سابقا للتكيف مع الجيل الجديد من محلل التدفق خارج الخلية Agilent Seahorse 24-wells (XFe24) مع لوحة التقاط الجزيرة. كما تم تحسين متوسط المقايسة وتركيزات مركب الحقن وعدد / مدة دورات الفحص لأنسجة الشبكية. يتم إعطاء بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لإعداد أقراص لكمة الشبكية. يمكن الحصول على مزيد من المعلومات حول إعداد البرنامج وتحليل البيانات من دليل المستخدم الخاص بالشركة المصنعة24,25,26.
Protocol
Representative Results
Discussion
وترد هنا تعليمات مفصلة لأداء المقايسات القائمة على الألواح الدقيقة من التنفس الميتوكوندريا ونشاط انحلال الجليكوليسيس باستخدام الجسم الحي السابق، وأقراص لكمة الشبكية تشريح حديثا. وقد تم تحسين البروتوكول إلى: 1) ضمان استخدام وسيطة المقايسة مناسبة للأنسجة الشبكية في الجسم الحي السا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل برنامج البحوث داخل العين التابع للمعهد الوطني للعيون (ZIAEY000450 وZIAEY000546).
Materials
| 1X PBS | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| 2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution | Sigma | D6134 | Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time |
| 30-gauge needle | BD Precision Glide | 305106 | |
| Antimycin A, 10 mM stock solution | Sigma | A8674 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Bam15, 10 mM stock solution | TimTec | ST056388 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Biopsy puncher, 1 mm | Integra Miltex | 33-31AA | |
| Cell-Tak | Corning Life Sciences | CB40240 | |
| CO2 asphyxiation chamber | |||
| Dissection forceps-Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-10 | Stright tip |
| Dissection forceps-Dumont #7 | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved tip |
| Dissection microscope | |||
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | Curved, Serrated tip |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15004-08 | Curved tip |
| NaOH solution, 1 M | Sigma-Aldrich | S8263 | Aqueous solution, prepare ahead of time |
| Rotenone, 10 mM stock solution | Sigma | R8875 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Seahorse calibration medium | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose | Agilent | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pyruvate | Agilent | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine | Agilent | 103579-100 | |
| Seahorse XF DMEM medium | Agilent | 103575-100 | pH 7.4, with 5 mM HEPES |
| Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak | Agilent | 103518-100 | Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate |
| Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer | Agilent | ||
| Sodium bicarbonate solution, 0.1 M | Sigma-Aldrich | S5761 | Aqueous solution, prepare ahead of time |
| Superfine eyelash brush | Ted Pella | 113 |
References
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye Brain. 2, 99-116 (2010).
- Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease. Progress in Retina and Eye Research. 20, 175-208 (2001).
- Barot, M., Gokulgandhi, M. R., Mitra, A. K. Mitochondrial dysfunction in retinal diseases. Current Eye Research. 36 (12), 1069-1077 (2011).
- Joyal, J. S., Gantner, M. L., Smith, L. E. H. Retinal energy demands control vascular supply of the retina in development and disease: The role of neuronal lipid and glucose metabolism. Progress in Retina and Eye Research. 64, 131-156 (2018).
- Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of Neuroscience Research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
- Haydinger, C. D., Kittipassorn, T., Peet, D. J. Power to see-Drivers of aerobic glycolysis in the mammalian retina: A review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1057-1071 (2020).
- Wright, A. F., et al. Lifespan and mitochondrial control of neurodegeneration. Nature Genetics. 36, 1153-1158 (2004).
- Bossy-Wetzel, E., Schwarzenbacher, R., Lipton, S. A. Molecular pathways to neurodegeneration. Nature Medicine. 10, 2-9 (2004).
- Leveillard, T., Philp, N. J., Sennlaub, F. Is retinal metabolic dysfunction at the center of the pathogenesis of age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), (2019).
- Vlachantoni, D., et al. Evidence of severe mitochondrial oxidative stress and a protective effect of low oxygen in mouse models of inherited photoreceptor degeneration. Human Molecular Genetics. 20 (2), 322-335 (2011).
- Grenell, A., et al. Loss of MPC1 reprograms retinal metabolism to impair visual function. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (9), 3530-3535 (2019).
- Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews in Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).
- Jarrett, S. G., Boulton, M. E. Consequences of oxidative stress in age-related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 399-417 (2012).
- Rozing, M., et al. Age-related macular degeneration: A two-level model hypothesis. Progress in Retina Eye Research. 76, 100825 (2020).
- Yokosako, K., et al. Glycolysis in patients with age-related macular degeneration. Open Ophthalmology Journal. 8, 39-47 (2014).
- Bek, T. Mitochondrial dysfunction and diabetic retinopathy. Mitochondrion. 36, 4-6 (2017).
- Yumnamcha, T., Guerra, M., Singh, L. P., Ibrahim, A. S. Metabolic dysregulation and neurovascular dysfunction in diabetic retinopathy. Antioxidants. 9 (12), (2020).
- Futterman, S., Kinoshita, J. H. Metabolism of the retina. I. Respiration of cattle retina. Journal of Biological Chemistry. 234 (4), 723-726 (1959).
- Linsenmeier, R. A. Effects of light and darkness on oxygen distribution and consumption in the cat retina. Journal of General Physiology. 88 (4), 521-542 (1986).
- Medrano, C. J., Fox, D. A. Oxygen consumption in the rat outer and inner retina: light- and pharmacologically-induced inhibition. Experiments in Eye Research. 61 (3), 273-284 (1995).
- Kooragayala, K. Quantification of oxygen consumption in retina ex vivo demonstrates limited reserve capacity of photoreceptor mitochondria. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Adlakha, Y. K., Swaroop, A. Determination of mitochondrial oxygen consumption in the retina ex vivo: applications for retinal disease. Methods in Molecular Biology. 1753, 167-177 (2018).
- . Agilent Mitocondrial stress test user guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021)
- . Agilent Glycolytic rate assay user guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf (2021)
- . Agilent wave 2.6 user guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf (2021)
- . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals Available from: https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf (2021)
- . Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology Available from: https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf (2021)
- . Report Generator User Guide Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf (2021)
- . Agilent Seahorse XF Buffer Factor Protocol Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf (2021)
- . Agilent sensor cartridges and cell culture microplates Available from: https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf (2021)
- . Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021)
- Fan, Y. Y. A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309, 1-9 (2015).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (10), 3890-3895 (2006).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).
- Corso-Diaz, X., et al. Genome-wide profiling identifies DNA methylation signatures of aging in rod photoreceptors associated with alterations in energy metabolism. Cell Reports. 31 (3), 107525 (2020).
- Berkowitz, B. A., et al. Mitochondrial respiration in outer retina contributes to light-evoked increase in hydration in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (15), 5957-5964 (2018).
- Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
