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神经科学

Determinação da respiração mitocondrial e glicolise em amostras de tecido retinal ex vivo

Published: August 04, 2021
doi:
10.3791/62914
, ,
1Neurobiology, Neurodegeneration & Repair Laboratory, National Eye Institute,National Institutes of Health

Summary

Descrito aqui é um protocolo detalhado para a realização de ensaios de estresse mitocondrial e ensaio de taxa glicólítica em amostras de tecido de retina ex vivo usando um bioanalzer comercial.

Abstract

A respiração mitocondrial é um caminho crítico gerador de energia em todas as células, especialmente fotorreceptores de retina que possuem um metabolismo altamente ativo. Além disso, fotorreceptores também exibem alta glicólise aeróbica como células cancerosas. Medições precisas dessas atividades metabólicas podem fornecer informações valiosas sobre a homeostase celular em condições fisiológicas e em estados de doenças. Ensaios baseados em microplacos de alto rendimento foram desenvolvidos para medir a respiração mitocondrial e várias atividades metabólicas em células vivas. No entanto, a grande maioria delas são desenvolvidas para células cultivadas e não foram otimizadas para amostras de tecido intacto e para aplicação ex vivo. Descrito aqui é um protocolo passo-a-passo detalhado, utilizando a tecnologia de fluorescência baseada em microplaca, para medir diretamente a taxa de consumo de oxigênio (OCR) como um indicador de respiração mitocondrial, bem como taxa de acidificação extracelular (ECAR) como um indicador de glicolise, em tecido de retina ex vivo intacto. Este método tem sido usado para avaliar com sucesso as atividades metabólicas na retina do camundongo adulto e demonstrar sua aplicação na investigação de mecanismos celulares de envelhecimento e doença.

Introduction

Mitocôndrias são organelas essenciais que regulam o metabolismo celular, sinalização, homeostase e apoptose coordenando múltiplos processos fisiológicos cruciais1. Mitocôndrias servem como a potência na célula para gerar triphosfato de adenosina (ATP) através da fosforilação oxidativa (OXPHOS) e fornecem energia que suporta quase todos os eventos celulares. A maioria do oxigênio celular é metabolizada em mitocôndrias, onde serve como o aceitador final de elétrons na cadeia de transporte de elétrons (ETC) durante a respiração aeróbica. Baixas quantidades de ATP também podem ser produzidas a partir da glicolise no citosol, onde a glicose é convertida em piruvato, que pode ser ainda convertida em lactato ou ser transportada para mitocôndrias e oxidada para acetil-CoA, um substrato no ciclo de ácido tricarboxílico (ciclo TCA).

A retina é um dos tecidos mais metabolicamente ativos em mamíferos2, apresentando altos níveis de respiração mitocondrial e consumo de oxigênio extremamente alto3. Os fotorreceptores da haste e do cone contêm uma alta densidade de mitocôndrias4, e oxphos gera a maioria de ATP na retina5. Além disso, a retina também depende fortemente da glicólise aeróbica6,7, convertendo glicose em lactato5. Os defeitos mitocondriais estão associados a diversas doenças neurodegenerativas8,9; e com suas demandas únicas de alta energia, a retina é especialmente vulnerável a defeitos metabólicos, incluindo aqueles que afetam oxphos4 mitocondrial4 e glicolise10. A disfunção mitocondrial e os defeitos na glicólise estão implicados em doenças degenerativas da retina 11,12 e macular13, degeneração macular relacionada à idade10,14,15,16 e retinopatia diabética17,18. Portanto, medições precisas da respiração mitocondrial e da glicolise podem fornecer parâmetros importantes para avaliar a integridade e a saúde da retina.

A respiração mitocondrial pode ser medida através da determinação da taxa de consumo de oxigênio (OCR). Dado que a conversão da glicose em piruvato e, posteriormente, para lactato resulta em extrusão de prótons em e acidificação do ambiente extracelular, as medidas da taxa de acidificação extracelular (ECAR) fornecem uma indicação de fluxo de glicolise. Como a retina é composta de múltiplos tipos de células com relações íntimas e sinergia ativa, incluindo a troca de substratos6, é imperativo analisar a função mitocondrial e o metabolismo no contexto de todo o tecido retinente com laminação intacta e circuitos. Nas últimas décadas, os eletrodos O2 tipo Clark e outros microeletrodos de oxigênio têm sido usados para medir o consumo de oxigênio na retina19,20,21. Esses eletrodos de oxigênio têm grandes limitações na sensibilidade, exigência de um grande volume amostral e a necessidade de agitação contínua da amostra suspensa, o que geralmente leva à interrupção do contexto celular e tecidual. O protocolo descrito aqui foi desenvolvido usando uma técnica de fluorescência à base de microplaca para medir o metabolismo de energia mitocondrial em tecido de retina de camundongos ex vivo recém-dissecado. Permite medições em tempo real de média entrada tanto do OCR quanto do ECAR simultaneamente usando uma pequena amostra (soco de 1 mm) de tecido ex vivo retina, evitando a necessidade de suspensão e agitação contínua.

Demonstrado aqui é o procedimento experimental para ensaio de estresse mitocondrial e ensaio de taxa glicolítico em discos de perfuração de retina recém-dissecados. Este protocolo permite a medição de atividades metabólicas relacionadas a mitocôndrias em um contexto de tecido ex vivo. Diferente dos ensaios realizados com células cultivadas, as leituras obtidas aqui refletem o metabolismo energético combinado no nível do tecido e são influenciadas por interações entre os diferentes tipos celulares dentro do tecido. O protocolo é modificado a partir de uma versão anteriormente publicada22,23 para se adaptar à nova geração do analisador Agilent Seahorse extracelular fluxo 24-wells (XFe24) com placa de Captura de Ilhéus. O meio de ensaio, as concentrações de compostos de injeção e o número/duração dos ciclos de ensaio também foram otimizados para o tecido retiniano. Um protocolo passo a passo detalhado é dado para a preparação de discos de perfuração de retina. Mais informações sobre a configuração do programa e análise de dados podem ser obtidas no guia de usuário do fabricante24,25,26.

Protocol

Todos os protocolos de camundongos foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais do Instituto Nacional de Olhos (NEI ASP nº 650). Os camundongos foram alojados em condições claras e escuras 12h e atendidos seguindo as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, do Instituto de Recursos Animais Laboratoriais e da Política de Serviços Públicos de Saúde sobre Cuidados Humanos e Uso de Animais de Laboratório. 1. Cartucho de sensor hidratante e preparação…

Representative Results

Os dados aqui relatados são ensaios representativos de estresse mitocondrial mostrando traços OCR (Figura 1) e ensaio de taxa glicolítico mostrando traços OCR e traço ECAR (Figura 2), que foram realizados usando discos de perfuração de retina de 1 mm recém-dissecados a partir de 4 meses de camundongos nrl-L-EGFP transgênicos de 4 meses de idade( fundo C57B/L6). Esses camundongos expressam GFP especificamente em fotorrece…

Discussion

Fornecido aqui estão instruções detalhadas para a realização de ensaios baseados em microplaca de atividade de respiração mitocondrial e glicolise usando discos de perfuração de retina ex vivo, recém-dissecados. O protocolo foi otimizado para: 1) garantir o uso de um meio de ensaio adequado para tecido de retina ex vivo; 2) empregar o tamanho adequado dos discos de perfuração de retina para obter leituras de OCR e ECAR que se enquadram no alcance ideal de detecção da máquina; 3) revestime…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho é apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do National Eye Institute (ZIAEY000450 e ZIAEY000546).

Materials

1X PBS Thermo Fisher 14190-144
2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution Sigma D6134 Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time
30-gauge needle BD Precision Glide 305106
Antimycin A, 10 mM stock solution Sigma A8674 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Bam15, 10 mM stock solution TimTec ST056388 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Biopsy puncher, 1 mm Integra Miltex 33-31AA
Cell-Tak Corning Life Sciences CB40240
CO2 asphyxiation chamber
Dissection forceps-Dumont #5 Fine Science Tools 11251-10 Stright tip
Dissection forceps-Dumont #7 Fine Science Tools 11274-20 Curved tip
Dissection microscope
DMSO Sigma D2438
Graefe forceps Fine Science Tools 11051-10 Curved, Serrated tip
Microscissors Fine Science Tools 15004-08 Curved tip
NaOH solution, 1 M Sigma-Aldrich S8263 Aqueous solution, prepare ahead of time
Rotenone, 10 mM stock solution Sigma R8875 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Seahorse calibration medium Agilent 100840-000
Seahorse XF 1.0 M glucose Agilent 103577-100
Seahorse XF 100 mM pyruvate Agilent 103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine Agilent 103579-100
Seahorse XF DMEM medium Agilent 103575-100 pH 7.4, with 5 mM HEPES
Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak Agilent 103518-100 Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate
Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer Agilent
Sodium bicarbonate solution, 0.1 M Sigma-Aldrich S5761 Aqueous solution, prepare ahead of time
Superfine eyelash brush Ted Pella 113
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References

  1. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  2. Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye Brain. 2, 99-116 (2010).
  3. Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease. Progress in Retina and Eye Research. 20, 175-208 (2001).
  4. Barot, M., Gokulgandhi, M. R., Mitra, A. K. Mitochondrial dysfunction in retinal diseases. Current Eye Research. 36 (12), 1069-1077 (2011).
  5. Joyal, J. S., Gantner, M. L., Smith, L. E. H. Retinal energy demands control vascular supply of the retina in development and disease: The role of neuronal lipid and glucose metabolism. Progress in Retina and Eye Research. 64, 131-156 (2018).
  6. Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of Neuroscience Research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
  7. Haydinger, C. D., Kittipassorn, T., Peet, D. J. Power to see-Drivers of aerobic glycolysis in the mammalian retina: A review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1057-1071 (2020).
  8. Wright, A. F., et al. Lifespan and mitochondrial control of neurodegeneration. Nature Genetics. 36, 1153-1158 (2004).
  9. Bossy-Wetzel, E., Schwarzenbacher, R., Lipton, S. A. Molecular pathways to neurodegeneration. Nature Medicine. 10, 2-9 (2004).
  10. Leveillard, T., Philp, N. J., Sennlaub, F. Is retinal metabolic dysfunction at the center of the pathogenesis of age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), (2019).
  11. Vlachantoni, D., et al. Evidence of severe mitochondrial oxidative stress and a protective effect of low oxygen in mouse models of inherited photoreceptor degeneration. Human Molecular Genetics. 20 (2), 322-335 (2011).
  12. Grenell, A., et al. Loss of MPC1 reprograms retinal metabolism to impair visual function. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (9), 3530-3535 (2019).
  13. Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews in Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).
  14. Jarrett, S. G., Boulton, M. E. Consequences of oxidative stress in age-related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 399-417 (2012).
  15. Rozing, M., et al. Age-related macular degeneration: A two-level model hypothesis. Progress in Retina Eye Research. 76, 100825 (2020).
  16. Yokosako, K., et al. Glycolysis in patients with age-related macular degeneration. Open Ophthalmology Journal. 8, 39-47 (2014).
  17. Bek, T. Mitochondrial dysfunction and diabetic retinopathy. Mitochondrion. 36, 4-6 (2017).
  18. Yumnamcha, T., Guerra, M., Singh, L. P., Ibrahim, A. S. Metabolic dysregulation and neurovascular dysfunction in diabetic retinopathy. Antioxidants. 9 (12), (2020).
  19. Futterman, S., Kinoshita, J. H. Metabolism of the retina. I. Respiration of cattle retina. Journal of Biological Chemistry. 234 (4), 723-726 (1959).
  20. Linsenmeier, R. A. Effects of light and darkness on oxygen distribution and consumption in the cat retina. Journal of General Physiology. 88 (4), 521-542 (1986).
  21. Medrano, C. J., Fox, D. A. Oxygen consumption in the rat outer and inner retina: light- and pharmacologically-induced inhibition. Experiments in Eye Research. 61 (3), 273-284 (1995).
  22. Kooragayala, K. Quantification of oxygen consumption in retina ex vivo demonstrates limited reserve capacity of photoreceptor mitochondria. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
  23. Adlakha, Y. K., Swaroop, A. Determination of mitochondrial oxygen consumption in the retina ex vivo: applications for retinal disease. Methods in Molecular Biology. 1753, 167-177 (2018).
  24. . Agilent Mitocondrial stress test user guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021)
  25. . Agilent Glycolytic rate assay user guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf (2021)
  26. . Agilent wave 2.6 user guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf (2021)
  27. . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals Available from: https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf (2021)
  28. . Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology Available from: https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf (2021)
  29. . Report Generator User Guide Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf (2021)
  30. . Agilent Seahorse XF Buffer Factor Protocol Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf (2021)
  31. . Agilent sensor cartridges and cell culture microplates Available from: https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf (2021)
  32. . Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021)
  33. Fan, Y. Y. A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309, 1-9 (2015).
  34. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  35. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  36. Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (10), 3890-3895 (2006).
  37. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).
  38. Corso-Diaz, X., et al. Genome-wide profiling identifies DNA methylation signatures of aging in rod photoreceptors associated with alterations in energy metabolism. Cell Reports. 31 (3), 107525 (2020).
  39. Berkowitz, B. A., et al. Mitochondrial respiration in outer retina contributes to light-evoked increase in hydration in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (15), 5957-5964 (2018).
  40. Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).

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Keywords: Mitochondrial RespirationGlycolysisEx VivoSeahorse AnalysisInherited Retinal DegenerationRetinal DissectionMouse RetinaFluorophore ActivationAssay MediumRetinal Punch Preparation
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Cite This Article
Jiang, K., Nellissery, J., Swaroop, A. Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples. J. Vis. Exp. (174), e62914, doi:10.3791/62914 (2021).
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