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神经科学

Ex Vivoのレティナル組織サンプルにおけるミトコンドリア呼吸と解糖の測定

Published: August 04, 2021
doi:
10.3791/62914
, ,
1Neurobiology, Neurodegeneration & Repair Laboratory, National Eye Institute,National Institutes of Health

Summary

ここで説明する、商業バイオアナライザを用いた ex vivo のレチナル組織サンプルにおけるミトコンドリアストレスアッセイおよび解糖率アッセイを行うための詳細なプロトコルを説明する。

Abstract

ミトコンドリア呼吸は、全ての細胞、特に高活性代謝を有するレチン系感光体の重要なエネルギー生成経路である。また、光受容体は癌細胞のような高い好気性解糖を呈する。これらの代謝活動の正確な測定は、生理学的状態および疾患状態における細胞恒常性に関する貴重な洞察を提供することができる。高スループットマイクロプレートベースのアッセイは、生細胞におけるミトコンドリア呼吸および様々な代謝活動を測定するために開発されています。しかし、これらの大部分は培養細胞用に開発されており、インタクトな組織サンプルやアプリケーション ex vivo用に最適化されていません。ここでは、マイクロプレートベースの蛍光技術を用いて、酸素消費速度(OCR)をミトコンドリア呼吸の指標として直接測定する詳細なステップバイステッププロトコル、ならびに細胞外酸性化率(ECAR)を解糖の指標として、無傷の ex vivo レチン組織で説明する。この方法は、正常に成人マウスのレティナの代謝活動を評価し、老化や病気の細胞機構を調査する際にそのアプリケーションを実証するために使用されています。.

Introduction

ミトコンドリアは、細胞代謝、シグナル伝達、ホメオスタシス、アポトーシスを複数の重要な生理学的プロセスを調整することによって調節する必須のオルガネラである1。ミトコンドリアは、酸化リン酸化(OXPHOS)を介してアデノシン三リン酸(ATP)を生成し、ほぼすべての細胞イベントをサポートするエネルギーを提供する細胞内の大国として機能します。細胞酸素の大部分はミトコンドリアで代謝され、好気呼吸中の電子輸送鎖(ETC)の最終的な電子アクセクサとして機能する。低量のATPは、グルコースをピルビン酸に変換するサイトゾルの解糖からも製造することができ、さらに乳酸に変換したり、ミトコンドリアに輸送したり、三カルボン酸サイクル(TCAサイクル)の基質であるアセチルCoAに酸化することができます。

このレティナは哺乳動物2において最も代謝活性の高い組織の1つで、高レベルのミトコンドリア呼吸と非常に高い酸素消費量を示す3。ロッドおよびコーン光受容体は、ミトコンドリア4の高密度を含み、OXPHOSは、retina5で最もATPを生成します。さらに、このレチナは、グルコースを乳酸5に変換することにより、好気性解糖6,7にも大きく依存しています。ミトコンドリア欠損症は、様々な神経変性疾患に関連しています8,9;そして、その独特の高エネルギー需要と, retinaは、特に代謝欠陥に対して脆弱です, ミトコンドリアOXPHOS4および解糖症10に影響を与えるものを含む.ミトコンドリア機能障害と解糖の欠損は、網膜11,12及び黄斑13変性疾患、加齢黄斑変性症10、14、15、16、および糖尿病網膜症17,18に関与している。したがって、ミトコンドリア呼吸および解糖の正確な測定は、レティナの完全性および健康を評価するための重要なパラメータを提供することができる。

ミトコンドリア呼吸は酸素消費率(OCR)の測定によって測定することができる。グルコースからピルビン酸への変換、そしてその後の乳酸塩への変換は、細胞外環境への陽子の押出および酸性化をもたらすことを考えると、細胞外酸性化率(ECAR)の測定は、グリコリシスフラックスの指標を提供する。このレティナは、基質の交換を含む、親密な関係と活発な相乗効果を持つ複数の細胞タイプで構成されるため、無傷のラミネーションと回路を持つ全レチン組織のコンテキストでミトコンドリアの機能と代謝を分析することが不可欠です。過去数十年にわたり、クラーク型O2電極および他の酸素マイクロ電極は、retina19,20,21における酸素消費量を測定するために使用されてきました。これらの酸素電極は、感度、大きなサンプル体積の要件、および通常、細胞および組織の文脈の破壊につながる懸濁試料の連続攪拌の必要性に大きな制限を有する。ここで説明するプロトコルは、ミトコンドリアのエネルギー代謝を解剖したばかりのex vivoマウスの残膜組織におけるミトコンドリアのエネルギー代謝を測定するマイクロプレートベースの蛍光技術を用いて開発された。それは懸濁および連続的なかき混ぜのための必要性を避けながら、ex vivoのレチナル組織の小さいサンプル(1mmのパンチ)を同時に使用してOCRとECARの両方の中間の実時間測定を可能にする。

ここで示されているのが、解剖したばかりのレチナルパンチディスク上のミトコンドリア応力アッセイおよび解糖率アッセイの実験手順です。このプロトコルは、ミトコンドリア関連代謝活動を、エキビボ組織のコンテキストで測定することを可能にする。培養細胞を用いて行うアッセイとは異なり、ここで得られた測定値は組織レベルでの結合されたエネルギー代謝を反映し、組織内の異なる細胞タイプ間の相互作用の影響を受ける。このプロトコルは、アイレットキャプチャプレートを備えたアジレントシーホース細胞外フラックス24ウェル(XFe24)アナライザの新世代に適応するために、以前に公開されたバージョン22,23から変更されます。アッセイ培地、注入化合物濃度、およびアッセイサイクルの数/持続時間も、レチン組織に対して最適化されています。レチナルパンチディスクの準備のために詳細なステップバイステッププロトコルが与えられています。プログラムのセットアップとデータ分析の詳細については、製造元のユーザーガイド24,25,26から入手できます。

Protocol

すべてのマウスプロトコルは、国立眼科研究所(NEI ASP#650)の動物のケアと使用委員会によって承認されました。マウスは12時間の明暗条件で収容され、実験動物のケアと使用のためのガイド、実験動物資源研究所、およびヒトケアと実験動物の使用に関する公衆衛生サービスポリシーの勧告に従って世話をしました。 1. センサカートリッジのハイドレートとアッセイ媒体の?…

Representative Results

ここで報告されるデータは、OCRトレースを示す代表的なミトコンドリア応力アッセイ(図1)およびOCRトレースおよびECARトレースを示す解糖率アッセイ(図2)であり、4ヶ月前のトランスジェニック Nrl-L-EGFP mice36 (C57B/L6バックグラウンド)から解剖したばかりの1mmのレチナルパンチディスクを使用して行った。これらのマウスは、?…

Discussion

ここでは、ex vivo、新たに解剖されたレチナルパンチディスクを使用してミトコンドリア呼吸および解糖活性のマイクロプレートベースのアッセイを実行するための詳細な手順を提供します。プロトコルは、次のように最適化されています: 1) ex vivoのレチン組織に適したアッセイ媒体の使用を保証します。2)は、マシンの最適な検出範囲内にあるOCRとECARの測定値を得るために、レ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、国立眼科研究所(ZIAEY000450およびZIAEY000446)の壁内研究プログラムによって支援されています。

Materials

1X PBS Thermo Fisher 14190-144
2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution Sigma D6134 Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time
30-gauge needle BD Precision Glide 305106
Antimycin A, 10 mM stock solution Sigma A8674 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Bam15, 10 mM stock solution TimTec ST056388 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Biopsy puncher, 1 mm Integra Miltex 33-31AA
Cell-Tak Corning Life Sciences CB40240
CO2 asphyxiation chamber
Dissection forceps-Dumont #5 Fine Science Tools 11251-10 Stright tip
Dissection forceps-Dumont #7 Fine Science Tools 11274-20 Curved tip
Dissection microscope
DMSO Sigma D2438
Graefe forceps Fine Science Tools 11051-10 Curved, Serrated tip
Microscissors Fine Science Tools 15004-08 Curved tip
NaOH solution, 1 M Sigma-Aldrich S8263 Aqueous solution, prepare ahead of time
Rotenone, 10 mM stock solution Sigma R8875 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Seahorse calibration medium Agilent 100840-000
Seahorse XF 1.0 M glucose Agilent 103577-100
Seahorse XF 100 mM pyruvate Agilent 103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine Agilent 103579-100
Seahorse XF DMEM medium Agilent 103575-100 pH 7.4, with 5 mM HEPES
Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak Agilent 103518-100 Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate
Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer Agilent
Sodium bicarbonate solution, 0.1 M Sigma-Aldrich S5761 Aqueous solution, prepare ahead of time
Superfine eyelash brush Ted Pella 113
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References

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Keywords: Mitochondrial RespirationGlycolysisEx VivoSeahorse AnalysisInherited Retinal DegenerationRetinal DissectionMouse RetinaFluorophore ActivationAssay MediumRetinal Punch Preparation
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Jiang, K., Nellissery, J., Swaroop, A. Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples. J. Vis. Exp. (174), e62914, doi:10.3791/62914 (2021).
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